Institutul de Biologie Bucuresti

Aributul vieţii – biodiversitatea – este un concept modern, utilizat pentru prima dată în 1986, la Foruml Naţional de Biodiversitate – Washingtom. Utilizarea oficială a termenuli a fost în 1988, prin publicarea cărţii “Biodiversity”, reluată în 1992 la Rio de Janeiro, pentru definirea variabilităţii vieţuitoarelor din toate tipurile de ecosisteme.

Epopeea biodiversităţii face trimitere la avatarurile acesteia, presărată cu “episoade” atmosferice, geologice, paleoclimatice şi paleoecologice de criză şi de înflorire a diferitelor grupe de vieţuitoare, începând cu aproximativ 3,8 miliarde de ani, prin evoluţia lor de-a lungul erelor geologice, până la ceea ce înţelegm astăzi prin biodiversitate. În afară de trecerea în revistă a concepţiilor şi teoriilor asupra originei vieţii pe Pământ, pentru desluşirea evoluţiei biodiversităţii ne folosim de datele paleontologiei, sistematicii, biogeografiei, (paleo)ecologiei, microbiologiei, botanicei şi zoologiei. O asemenea abordare poate permite ca pe fondul cunoştinţelor de bază din biologie să se elaboreze noi teme pentru viitoarele cercetări biologice, să se dezvolte noi concepte şi principii ale domeniului.

Dintre numeroasele teorii si ipoteze asupra originei vieţii pe Pământ nu lipsesc nici cele desprinse din domeniul geneticii (ex., teoriile ribotipului şi progenotului), după care se disting fie etapele precelulară, protocelulară şi celulară, fie structura ipotetică (progenotul) în care informaţia ereditară era determinată de acizii ribonucleici.

Dacă acceptăm ca fiind plauzibile scenariile apariţiei primelor structuri vitale (sisteme individuale instabile) pe Pământ, episoadele ulterioare (captarea energiei si metabolismul, reproducerea) au fost momente “eroice” în evoluţia acelor complexe de macromolecule spre coacervate sau microsfere, dar şi în evoluţia eubacteriilor şi arhebacteriilor, dacă pentru aproximativ 300.000 ani (între 3,8 şi 3,5 miliarde) lipsesc dovezile paleontologiei - fosilele. Abia rocile fosilifere vechi de 3,5 miliarde de ani conţin o biotă de bacterii remarcabil de bogată. În următorul miliard de ani (3,5 – 2,5) au existat numai procariote: cianobacterii, bacterii gram-negative şi gram-pozitive, bacterii purpurii, arhebacterii – toate lipsite de reproducere sexuată, dar cu transfer lateral de gene, ceea ce a determinat ca diferite subdiviziuni să conţină seturi de gene ale altor subdiviziuni şi în acest fel s-a estimat ca fiind exclusă noţiunea de specie biologică. Taxonomiştii văd totuşi arhebacteriile, diferite de celelalte procariote prin structura peretelui celular şi prin structura ribozomilor. Cavalier Smith (1998) a clasificat arhebacteriile drept una din cele patru mari subdiviziuni ale bacteriilor.

Acceptând că primele eucariote au apărut dintr-o simbioză a unei arhebacterii cu o eubacterie, găsim pe de o parte explicaţia de ce în eucariote există combinaţii ale caracteristicilor celor doi simbionţi, iar pe de altă parte înţelegem fenomenul dobândirii genomurilor suplimentare (la eucariotele primitive), prin transferul unilateral de gene (Margulis şi col., 2000).

Putem afirma aşadar că cel mai dramatic, dar şi cel mai important eveniment din întreaga istorie a vieţii pe Pământ a fost apariţia eucariotelor prin structurarea celulelor nucleate, dobândirea reproducerii sexuate prin meioză, după un milliard de ani de viaţă exclusiv bacteriană. Eucariotele primitive sau protistele au avut la rândul lor de dobândit organitele celulare: mitocondrii – din subdiviziunea α a bacteriilor purpurii şi cloroplalstele (în cazul plantelor) din cianobacterii. Pe de altă parte, protistele sunt şi astăzi lipsite de organite celulare, pentru că în decursul evoluţiei le-au pierdut. Mai întâi a fost o spectaculoasă diversificare a pprotisteloir, cu aproximativ 2,5 miliarde de ani în urmă. Margulis şi col. (1998) au recunoscut între ele 36 filumuri: amoebe, microsporidii, mucegaiurile mucilaginoase, dinoflagelatele, ciliatele, sprozoarele, criptomonadele, flagelatele, xantofitele, diatomeele, algele brune (unele chiar pluricelulare), oomicete, algele roşii, algele verzi, radiolarii etc., între ele descriind trei noi filumuri (Deinococci, Pirellulae, Thermotogae), pe care alţi autori le socotesc doar la nivel de clase.

Din agregarea formelor unicelulare (după unii ar fi agregat şi bacteriile) au rezultat specii pluricelulare, cu apogeul dezvoltării lor în cele trei mari regnuri: metafite, fungi şi metazoare. Încă din Precambrian (aprox. 635 - 542 mil. ani în urmă) a existat o explozie a biodiversităţii, pe când după imensa glaciaţiune marinoeană a urmat un puternic efect de seră, creşterea O2 în ocean şi disponibilitate de nutrienţi, rezultaţi din tectonica plăcilor continentale. Cambrianul (542 mil. ani) a fost o perioadă unică sub aspectul diversificării lumii animale, rămânând un episod deosebit de important în epopeea biodiversităţii.

În Cambrian, lumea marină s-a îmbogăţit cu noi forme de vieţuitoare, care au stat la originea faunei actuale: 13% specii de spongieri; 8% specii de viermi priapulizi, apoi brachiopode, moluşte, chordate – strămoşi ai vertebratelor. Identificarea între ele a unor prădători, demonstrează existenţa încă de pe atunci a unor relaţii trofice complexe; morfologia lor indică o mare capacitate motrice şi senzorială. În acea diversificare a biodiversităţii, prăzile au evoluat sub presiunea prădătorilor, iar prădători au evoluat în funcţie de resursele de hrană disponibile; această strânsă interacţiune a favorizat aşa-numita explozie cambriană a biodiversităţii.

Neexistând nicio fosilă a strămoşului animalelor cu simterie bilaterală s-a făcut trimiterea la platelmintul Convolutriloba longifissura, de formă ovală şi culoare vie, care trăia în apele marine, puţin adânci, cu fund nisipos. El era acelomat, cu anatomie simplă (fără cap, fără gură, deschiderea sistemului digestiv neavând o poziţie fixă, iar sistemul nervos era difuz), dar cu cili pe epidermă, pentru deplasarea în apă; astăzi este reprezentat prin aprox. 100 de specii. După alţi cercetători însă, strămoşul bilateralelor trebuia să fie mai complex organizat decât acelomatele. De aceea, încă nu este sigur dacă bilateralele au rezultat dintr-un platelmint sau dintr-un anelid – şi acela lipsit de sistem nervos condensate, de tub digestiv complet, dar cu dschidere bucală şi anală distincte.

Prin analizarea şi compararea genelor ansamblului de animale actuale, filogenia moleculară ne conduce spre simplul raţionament, după care, cu cât structurile genetice a două specii sunt mai apropiate, cu atât speciile respective trebuie să fie mai strâns înrudite. Astfel, la baza arborelui filogenetic stau spongierii (fără adevărate ţesuturi şi fără plan de simetrie a corpului), urmaţi de cnidari, lipsiţi de organe, dar cu ţesuturi distincte (diploblastice) şi simetrie radială. Bilateralele (triploblasticele) cuprind protostomieni (cu blastoporul gastrular devenit deschidere bucală) şi deuterostomieni (incluzând vertebratele) la care, blastoporul devine orificiul anal .

Intrând în epoca Phanerozoică (între Cambrian – Holocen) este de reţinut extincţia în masă şi afectarea biodiversităţii de la sfârşitul Permianului şi altă extincţie de la sfîrşitul Cretacicului. Peştii gnatostomi au apărut din Ordovician (450 mil. ani). Sarcopterigienii – din Silurian (410 mil. ani). Muşchii de pământ şi amfibienii datează din Devonian (370 mil. ani). Reptilele din carbonifer (310 mil. ani). Angiospermele, păsările şi mamiferele – din Triasicul superior (225 mil. ani).

Până în prezent sunt descrise 320.000 specii de plante, 300.000 - alge şi 500.000 specii de fungi. Protozoarele figurează cu 100.000 specii, iar regnul animal – cu 5.570.000 specii, între care 4 milioane sunt numai insectele. Totalul de aproape 7 milioane de specii din lumea vie actuală, pare a fi doar 1/3 din câte specii se estimează că există pe glob.

Pe de o parte, sistematicienii încă au imens de inventariat ca specii necunoscute, iar pe de altă parte - după crizele depăşite glorios de-a lungul erelor geologice, astăzi biodiversitatea este supusă unei noi crize, accelerată de efectele activităţilor omului, acesta fiind ca un virus pentru întregul organism planetar. Profilaxia sau tratarea din timp a “bolii” planetei va oferi o perspectivă îndelungată de evoluţie a biodiversităţii, cu întâmplări epopeice.

BIBLIOGRAFIE (selectivă)

CAVALIER-SMITH T., 1998 – A revised six-kingdom system of life. Biological Review, 73: 203 – 266.

DARWIN CH., 1859 – On the Origin of Species by means of Natural Selection or the Preservation of favoured races in the struggle for life. London, Ed. John Murray: 1 – 484.

KLINGLER C., J.-O. BARUCH, 2009 – L’explosion de la vie animale. La Recherche No. 428: 32 – 47.

MARGULIS L., M.F. DOLAN, R. GUERRERO, 2000 – The chimeric eukaryote: origin of the nucleus from the karyomastigont in amitochondriate protists. Proceedings of the National Academy of Sciences 97: 6954 – 6959.

MARGULIS L., K.V.SCHWARTZ, 1998 – Five Kingdoms. An Illustrated Guide to the Phyla of Life on Earth. 3-rd ed.,W.H. Freeman Custom Publishing, New York: 1 - 100.

MAYR E., 2008 – De la bacterii la om. Evoluţia lumii vii. Ed. Humanitas, Bucureşti: 1 – 342.

WILSON E.O., 1988 – Biodiversity. Ed. Frances M. Peter, Associate Editor National Academy Press – Washington, D.C.: 1 – 538.

Top

Mecanisme moleculare si celulare ale interactiunilor dintre microorganisme si plante

Prof.dr. Calina Petruta Cornea

Facultatea de Biotehnologii Bucureşti

Bolile plantelor produse de fungi şi bacterii patogene determină pierderi însemnate de recoltă în cazul plantelor de interes agricol sau horticol. Aceste pierderi se traduc atât prin reducerea resurselor alimentare cât şi printr-o calitate scăzută a acestora. De-a lungul timpului, pentru combaterea diverselor boli ale plantelor au fost elaborate o serie de metode chimice de control, metode care nu întotdeauna s-au dovedit eficiente, costurile au fost ridicate iar impactul asupra mediului ambiant este deseori negativ.

Controlul biologic oferă o abordare ecologică a managementului bolilor plantelor şi poate fi integrat cu succes în sistemul integrat de management al bolilor, fiind un component major al unei agriculturi durabile. Cu toate beneficiile controlului biologic care este mult mai sigur decât cel chimic, eficienţa în combatere este mai scăzută comparativ cu compuşii chimici. Agenţii de control biologic sunt, prin însăşi natura lor, mult mai limitaţi comparativ cu pesticidele clasice, fiind necesară stabilirea exactă a spectrului lor de acţiune şi caracterizarea lor. Aceste aspecte au condus la numeroase studii asupra agenţilor biologici de control, pentru înţelegerea mecanismelor de acţiune şi pentru explorarea unor noi abordări biotehnologice.

Agenţii biologici, reprezentaţi de tulpini de bacterii, drojdii şi fungi filamentoşi pot acţiona pe mai multe direcţii:

- pot creşte mai repede sau pot utiliza mai eficient anumite resurse nutritive comparativ cu patogenii ţintă, fiind competitori au acestora şi împiedicându-i să se dezvolte (competiţia pentru nutrienţi);

- pot produce şi elimina în mediu diverşi metaboliţi care încetinesc sau chiar omoară patogenii aflaţi în apropierea respectivelor substanţe (antibioza);

- pot determina plantele să sintetizeze compuşi proprii care să prevină infecţia sau să omoare patogenii (rezistenţa indusă);

- pot acţiona direct în sau pe patogen determinând distrugerea acestuia (parazitism).

Biopreparatele obţinute pe baza unor asemenea microorganisme nu sunt poluante, sunt biodegradabile şi pot asigura atât protecţia faţă de acţiunea unor patogeni cât şi stimularea dezvoltării plantelor, acţionând ca biostimulatori naturali.

Cele mai multe studii au fost efectuate cu bacterii din genurile Bacillus şi Pseudomonas şi cu fungi din genul Trichoderma, la care au fost examinate, în detaliu, mecanismele de acţiune. Dintre acestea, cel mai important este micoparazitismul care presupune recunoaşterea, legarea şi degradarea enzimatică a peretelui celular al fungilor fitopatogeni ţintă. Cea mai mare parte a sistemului antifungic constă dintr-un număr semnificativ de gene ce codifică pentru o gamă variată de enzime litice extracelulare: endochitinaze, N-acetil-β-glucozaminidaze; chitin 1,4-β-chitobiozidaze; proteaze; endo- şi exoglucan β-1,3-glucozidaze; endoglucan β-1,6-glucozidaze; lipaze, xilanaze, mananaze; pectinaze; pectin liaze; amilaze; fosfolipaze; DN-aze şi RN-aze. In afara enyimelor, microorganismele antagoniste pot produce o gama variată de compuşi inhibitori, de tipul lipopeptidelor, 2,4–diacethylphloroglucinol (DAPG), fenazinele (phz), pyrolnitrinul (PRN), pyoluteorin (PLT), diverşi acizi organici (HCN), lectine etc. Pentru activitatea de biocontrol, cea mai mare importanţă o au enzimele chitinolitice şi glucanolitice care asigură, pe de o parte, degradarea unor compuşi specifici din peretele celular fungic şi, pe de altă parte pot induce o serie de mecanisme de protecţie la nivelul plantei. In acelaşi timp, biopreparatele microbiene pot conţine, pe lângă celule microbiene vii, o serie de compuşi macromoleculari sau diverse substanţe chimice de origine biologică (inclusiv provenite de la patogeni) care au efect elicitor, stimulând sistemele de apărare ale plantelor ţintă.

Deseori, elicitorii induc o creştere a nivelului unor compuşi de tipul apei oxigenate care pot determina o puternică acţiune antimicrobiană şi pot conduce la generarea unor derivaţi activi ai unor acizi graşi. In plus, stimularea producerii de compuşi oxidativi de tipul H₂O₂ conduce la activarea transcrierii unor gene ale plantei, implicate în apărare şi acumularea proteinelor codificate: chitinaze, glucanaze, endopoligalacturonaze. Asemenea enzime contribuie la eliminarea unor elicitori endogeni de tipul oligomerilor pectici, a glicoproteinelor bogate în hidroxiprolină şi a inhibitorilor proteazici. Răspunsul de hipersensibilitate la moartea celulară de la locul de infecţie a fost observat de mai multe grupuri de cercetători.

Dezvoltarea şi diversificarea tehnicilor de biologie moleculară au permis studii aprofundate legate de baza genetică a mecanismelor de antagonism microbien, de identificare a căilor moleculare de reglare a anumitor gene microbiene sau vegetale implicate, mai ales, în inhibarea fitopatogenilor şi în rezistenţa faţă de aceştia.

Top

ORIGINEA ŞI EVOLUŢIA COMPLEXITĂŢII GENOMULUI

Anca Păunescu

Institutul de Biologie Bucureşti, anca.paunescu@ibiol.ro

Complexitatea genomică variază în limite largi la diversele forme de viaţă, diferenţele cele mai evidente fiind descrise între genomul procariot şi cel eucariot. Procariotele au în general un genom compact, format mai ales din nucleotide care codifică sinteza de proteine, spre deosebire de eucariote la care se deosebesc mai multe categorii de ADN necodificator cum ar fi regiunile intergenice, intronii, regiunile netranscrise şi elementele transpozabile. Numărul de gene precum şi ponderea ADN-ului necodificator variază semnificativ şi între diferitele grupe de eucariote. Se consideră că există o corelaţie pozitivă între dimensiunea (exprimată în număr de gene) şi complexitatea genomului. În general, atât dimensiunea cât şi complexitatea cresc de la procariote, la eucariotele unicelulare, atingând un maxim la eucariotele pluricelulare. Această ipoteză, acceptată aproape unanim până nu demult, a pus bazele geneticii evoluţioniste. Genetica evoluţionistă nu poate explica însă de ce complexitatea genomului la Drosophila este superioară celei de la Cenorhabitis elegans cu toate că acesta conţine aproape 5000 de gene în plus şi nici de ce poliploizii la plante nu au o organizare mai complexă decât cea a diploizilor înrudiţi. Relativ recent a fost enunţată o teorie nouă non-evoluţionistă (Lynch & Conerly, 2003) care explică dezvoltarea complexităţii genomului ca fiind rezultatul unor procese aleatorii, non-adaptative. Această teorie a creat vii controverse privind dezvoltarea complexităţii genomului. S-a pus din ce in ce mai serios întrebarea dacă apariţia genomului complex este o consecinţă a evoluţiei adaptative sau a unui mecanism aleator ca cel al derivei genetice? Levine & Tjian (2003) aduc ca argument ipoteza că există o corelaţie pozitivă între complexitatea genomică şi numărul factorilor de transcripţie per genă. De exemplu, genomul drojdiilor conţine aproximativ 300 factori de transcripţie, Drosophila 1000 iar omul aproape 3000. În sprijinul acestei ipoteze vine şi observaţia că la organismele superioare regiunea promotor este mult mai extinsă, de asemenea, şi varietatea de complexe proteice reglatoare care determină o specializare tisulară crescută. Expresia genică ţesut specifică a avut astfel un rol determinant în dezvoltarea complexităţii structurale şi funcţionale a organismelor vii. Ideea că modificările se produc mai ales la nivelul genelor reglatoare, ar putea explica de ce diferenţele semnificative între complexitatea unor organisme nu sunt întotdeauna dublate şi de diferenţe semnificative privind numărul de gene. Deşi nu s-a ajuns încă la un consens privind care dintre cele două ipoteze privind dezvoltarea complexităţii genomului este cea validă, cele mai noi date de genetică moleculară (secvenţierea a tot mai multe genomuri, descifrarea mecanismelor de reglaj transcriptional şi post-transcripţional) vor putea oferi argumente care să ducă la elucidarea acestei dileme a genomicii contemporane.

Top

ARHITECTURA PLANTEI REZULTAT AL UNUI PUZZLE DE PROCESE MORFOGENETICE LA NIVELURI DIFERITE DE ORGANIZARE

Monica Elena Mitoi

Institutul de Biologie Bucureşti, monica.carasan@ibiol.ro

Planul corpului în regnul animal este închis şi determinat, în timp ce la plante este deschis şi nedeterminat. Cum acest plan simplu devine elaborat într-un vast aranjament de morfologii? Răspunsul: aceste plante posedă meristeme terminale, intercalare şi în unele cazuri meristeme laterale care conduc la diversificarea planului de bază şi generează o diversitate de arhitecturi ale corpului vegetal. Avantajul este separarea spaţială a zonelor meristematice în care celulele se formează, diferenţiază şi se specializează, de zonele funcţionale unde se găsesc celulele mature responsabile de fotosinteză, transportul moleculelor organice şi anorganice, astfel încât planta poate creşte continuu menţinându-şi activitatea metabolică. Diversitatea de forme apărută la plantele actuale arată că arhitectura depinde mult de funcţia şi determinarea meristemelor apicale şi poate evolua prin modificarea funcţiilor meristemului, acesta fiind un generator al formelor intermediare de creştere ale unei plante.

Aspectele privitoare la meristeme şi axele de dezvoltare ale diverselor structuri sunt actual subiecte de studiu ale fiziologiei şi geneticii, iar analizele moleculare ar putea aduce informaţii noi privind reglarea funcţiei meristemelor şi a capacităţii de a genera noi arhitecturi în cadrul plantei.

Arhitectura plantelor vasculare este dependentă în mare măsură de pattern-ul spaţio-temporal al activităţii meristemelor. Meristemele sunt regiuni de dezvoltare care alcătuiesc morfologia plantelor şi numeroase studii au vizat rolul hormonilor vegetali în aceste procese. În ultima decadă s-au identificat gene importante în creşterea specifică a organelor la diferite stadii de dezvoltare ale plantei, iar acum se iniţiază o perioadă de studii ce vizează mecanismul de acţiune al acestor gene. Astfel se doreşte să se determine rolurile relative ale genelor care sunt implicate în percepţia şi transducţia semnalelor, precum şi factorii de transcripţie şi elementele promotor ce influenţează diferite morfologii, în ce măsură genele ţintă sunt implicate în evoluţia arhitecturală, cum aceste gene complexează sau modulează aceste procese.

Dezvoltarea post embrionară este iniţiată de la nivelul meristemelor apicale: vegetativ, respectiv radicular şi constă în generarea diferitelor structuri anatomice. La plantele superioare depinde de organizarea funcţională a meristemelor care este stabilită în cursul embriogenezei. În acest sens, dezvoltarea florilor poate fi văzută ca o modificare a programului de lăstărire.

Multe studii ce interesează biologia dezvoltării abordează subiecte legate de embriogeneză sau procese ce se raportează la aceasta dezvoltarea ovulului şi a endospermului, maturarea seminţelor, altele se concentrează pe procese post-embrionare de caulogeneză, de dezvoltare şi tranziţie a meristemelor.

Originea embrionară a meristemului vegetativ era un punct controversat, însă recent s-a evidenţiat că formarea meristemului vegetativ este un proces dinamic de care depinde întreaga arhitectură şi dezvoltare a sistemului aerian la plante, care este iniţiat în regiunea apicală a embrionului şi că viitorul celulelor meristematice este limitat la un mic grup de celule localizat între bazele celor două primordii cotiledonare, care va da naştere unităţilor fitomerice ale plantei adulte. Organizarea meristemul vegetativ funcţional a fost înţeleasă prin descoperirea unui grup de celule care servesc ca centru organizatoric care îşi menţin nedeterminarea proprie celulelor stem formând zona centrală. Această constatare a fost extrapolată şi s-a făcut o paralelă cu organizarea funcţională a meristemului radicular în jurul centrului pasiv.

Meristemele apicale pot fi astfel văzute fie ca active, ca structuri ce îşi autoreglează funcţionarea, fie ca unităţi neautonome sau pasive, ca un grup de celule nediferenţiate, în diviziune care sunt modelate prin informaţiile trimise de la celule diferenţiate înconjurătoare în procesul de formare a pattern-urilor şi morfogeneză.

Arhitectura plantei adulte este determinată de modelul de ramificare a lăstarului care depinde de perioada de activitate a meristemului vegetativ primar ca şi de iniţierea situsului de activitate a meristemelor vegetative. În ceea ce priveşte sistemul radicular, acesta pare a fi mult mai oportunist în dezvoltarea sa decât sistemul vegetativ care este limitat de natura determinativă a unităţilor din care este compus. Astfel noile rădăcini laterale pot fi formate oricând în răspuns la condiţiile locale de mediu, acestea oferind oportunităţi de modificare a întregii arhitecturi radiale.

Frunzele sunt organe laterale iniţiate de la meristemul apical vegetativ. Prin identificarea genelor ce au relevanţă în procesul de formare şi producere de noi frunze, morfogeneza frunzei a devenit accesibilă unei analize mecanice a dezvoltării. Prin determinarea modului cum interacţionează aceste gene în stabilirea primordiului foliar, în direcţionarea creşterii polare de-a lungul axelor şi în stabilirea variatelor tipuri celulare se poate realiza o imagine de ansamblu asupra procesului morfogenetic la nivelul frunzei.

Un alt tip de organe de diferenţierea cărora este responsabil tot meristemul apical vegetativ sunt florile. S-a făcut un mare pas în înţelegerea dezvoltării florilor, floarea fiind cel mai complex şi atractiv organ al sistemului aerian la plante. Se cunoaşte de mult timp ca organele florale reprezintă frunze modificate, presupunând că stadiu vegetativ de frunză este baza stadiului floral.

Prin descoperirea mutanţilor homeotici în care primordiile diferenţiază normal în organe mature, dar în poziţii diferite şi prin identificarea genelor care determină soarta unui primordiu floral s-a realizat un progres semnificativ în înţelegerea dezvoltării plantei. Pentru o înţelegere completă a modului în care diferitele organe florale adoptă identităţi unice în timpul dezvoltării florilor trebuie studiat comportamentul şi interacţiile combinatorii între diferitele clase de gene homeotice florale, dar şi mecanismul de acţiune al produşilor acestora proteinele, ce formează complexe multimerice de acţiune, care se dovedesc a fi bazele moleculare reale ce determină dezvoltarea ulterioară a celulelor şi ţesuturilor.

Toate aceste progrese realizate în înţelegerea procesului de morfogeneză care afectează planul general sau modul cum este construită planta sunt piese ale unui puzzle care va da în viitor o imagine completă a procesului de dezvoltare al plantei întregi.

Top

TRAHEOGENEZA “IN VITRO”, SISTEM MODEL PENTRU STUDIUL PROCESELOR CITODIFERENŢIERII ŞI A MORŢII CELULARE PROGRAMATE LA PLANTE (MCP)

Aurelia Brezeanu

Institutul de Biologie Bucureşti, aurelia.brezeanu@ibiol.ro

Traheogeneza sau xilogeneza reprezintă un proces complex, un exemplu interesant al modului în care procesele de dezvoltare pot fi reglate prin manifestarea morţii celulare programate.

In situ xilogeneza este iniţiată în decursul dezvoltării embrionare şi continuă pe parcursul vieţii plantei prin formarea de la celule procambiale şi cambiale de noi tipuri celulare şi anume celule traheale (xilematice) care împreună alcătuiesc xilemul. Acestea sunt celule înalt diferenţiate care formează sistemul conducător al plantei, structură rigidă cu rol în transportul la distanţă a sevei brute. În decursul stadiilor finale ale diferenţierii traheelor, celula manifestă îngroşări secundare ale peretelui celular ce-i conferă o structură particulară urmat de pierderea conţinutului celular, prin autoliză şi ulterior prin moarte celulară. Moartea celulei reprezintă în acest caz un proces activ, complex, benefic, esential pentru supravieţuirea organismului în intregul său, ceea ce a condus la considerarea sa drept un exemplu tipic de realizare a MCP de tip apoptotic la plante. Din acest moment cercetările asupra traheogenezei s-au amplificat legat de necesitatea cunoaşterii modului de realizare şi a mecanismelor implicate în derularea apoptozei la plante comparativ cu sistemul animal.

Date interesante s-au obţinut folosind culturile “in vitro” care au permis considerarea traheogenezei in vitro” drept sistem model pentru studiul proceselor de citodiferenţiere şi moarte celulară programată la plante. S-a demonstrat experimental că traheogeneza se manifestă frecvent în cultura de calus dar şi în suspensii celulare sau protoplaşti. Avantajul acestui sistem constă în faptul că oferă posibilitatea obţinerii unei populaţii celulare bogate care poate fi determinată să realizeze mai mult sau mai puţin sincron acest proces, ceea ce permite analiza citologică, biochimică şi moleculară a principalelor evenimente ce il acompaniază. Permite, de asemenea, explorarea efectelor unor variate tipuri de molecule cu rol de semnal precum fitohormoni şi inhibitori ai acestora. Mai mult, o populaţie pură de celule poate servi drept sursă valoroasă de la care să se poată izola gene care să se exprime specific în decursul diferenţierii vasculare (Chasan-1994).

În contrast, folosirea în asemenea studii a organismului în intregul său nu permite analiza simultană decât a câtorva celule care se află poziţionate la nivelul unor organe şi ţesuturi diferite suferind prin aceasta, influenţele corelative a variate tipuri celulare. Date importante în acest sens au adus cercetările lui Fukuda şi Kamamine (1980 a şi b) asupra transdiferenţierii celulelor izolate din mezofil şi protoplaştii de mezofil de Zinnia elegans care au demonstrat pentru prima dată modul în care, celule de mezofil izolate mecanic prin mojararea frunzelor, pot suferi procese de dediferenţiere şi rediferentiere în traheide în absenţa unor diviziuni celulare, aşa cum se descrisese anterior. Acest sistem a permis studiul complex, morfologic, fiziologic, biochimic şi molecular al diferenţierii traheelor au făcut posibilă evidenţierea cu mare precizie a evenimentelor genetice ce au loc în decursul diferentierii lor progresive. Cascada expresiei genelor ce determină fenotipurile citologice ale traheelor in vitro se consideră a fi similară cu ceea ce se petrece in situ. Celulele traheale diferenţiate se caracterizează prin dezvoltarea unor îngroşări secundare, caracteristice ale peretelui celular care se asociază cu creşterea conţinutului în tubulină şi aranjament ordonat al microtubulilor, o creştere în paralel a activităţii enzimelor implicate în lignificarea secundară a peretelui celular precum fenilalanil amonioliaza - (PAL) care catalizează producerea acidului transcinamic implicat în formarea monolignolului şi ulterior a ligninei, sinteza a variate enzime hidrolitice precum proteaze (cistein proteaze, serin proteaze) nucleaze (ADN- aze şi ARN-aze) care sunt stocate în vacuom. Acesta cunoaşte o creştere dramatică în decursul stadiilor avansate ale diferenţierii fiind implicat în autoliza protoplastului. Studiile de biologie celulară au subliniat rolul major al vacuomului în faza de execuţie a morţii celulare asigurând eliminarea conţinutului celular mort. Plantele, datorită peretelui celular rigid nu posedă fenomene de fagocitoză, nu posedă nici macrofage şi neutrofile care să susţină acest proces. De aceea studiul vacuomului ca organit major implicat în MCP la plante s-a intensificat demonstrând că acesta este un organit celular important, extrem de dinamic şi versatil. Cronshow şi Bouck (1965) au lansat pentru prima dată ideea implicării sale în MCP din timpul traheogenezei iar apoi Groover (1997) a evidenţiat clar prin videocinematografie distrugerea trabeculelor citoplasmatice concomitent cu manifestarea colapsului vacuolar şi declanşarea autolizei. Colapsul vacuolar este reglat de celulă, nu este determinat de o “cădere metabolică” aşa cum se petrecea în cazul necrozei. Este ca şi cum celula posedă o serie de “ace moleculare” reprezentate de ionii de calciu, care perturbă integritatea tonoplastului determinând eliberarea hidrolazelor stocate în vacuum. Funcţionează astfel ca o “bombă de suicid” detonată de către fluxul de calciu. Analiza TUNEL (ce se consideră a fi marker sensibil al apoptozei) a evidenţiat o corelare a celor două procese, colaps vacuolar - degradare a cromatinei nucleare (Jones - 2001). Autoliza celulară este calciu dependentă. În decursul diferenţierii traheilor au fost evidenţiate proteaze şi anume, cel puţin 3 serin proteaze, cistein proteaze şi nucleaze de tip S₁ specifice apoptozei celulei animale. Fukuda şi colab. (1977) consideră că autoliza şi sinteza enzimelor hidrolitice se desfăşoară concomitent. După alte opinii enzimele hidrolitice se acumuează în vacuum anterior distrugerii tonoplastului aşa încât formaţiunile celulare implicate în biosinteza lor să nu fie afectate. Compartimentul vacuolar constituie o condiţie obligatorie prin stocarea în celule în cursul diferenţierii, a întregului set de enzime necesare derulării programului apoptotic. Vacuomul vine să dea în acest fel răspuns şi întrebării, dacă în traheogeneză putem vorbi de apoptoză, care este un proces fiziologic activ, sau nu. Este evident că celulele trebuie să fie în primul rând metabolic active pentru a putea sintetiza hidrolazele de care au ulterior nevoie, pe care le stochează în vacuom şi le eliberează când vacuomul intră în colaps.

Degradarea tonoplastului se asociază cu modificări în organizarea organitelor celulare şi a peretelui celular primar. Lignificarea peretelui celular apare după dezorganizarea tonopastului iar plasmalema rămâne intactă până ce toate organitele celulare dispar ca entităţi cu structură tipică. O problemă încă controversată o constituie existenţa unei interrelatii între formarea peretelui celular secundar şi procesul de lignificare. S-a postulat că depozitarea ligninei pare să necesite prezenţa matricei celulozice, idee încă controversată.

Un sistem experimental interesant care permite evidenţirea unor elemente importante legate de interacţia traheogeneză – citodiferenţiere - apoptoză îl reprezintă ţesutul tumoral de tip crown gall diferenţiat în urma infecţiei cu bacteria Gram negativă fitopatogenă din sol Agrobacterium tumefaciens. Cercetări efectuate în laboratorul nostru în ultimii ani au evidenţiat abundenţa în ţesutul tumoral a traheidelor (ceea ce conferă acestuia o consistenţă dură), determinată probabil de nevoia unei aprovizionări mai eficiente cu nutrienţi (Brezeanu şi colab. 1996, 2001, 2002, Voichiţă şi colab. 2004). Distribuţia elementelor traheale este cu totul particulară extrem de sofisticată comparativ cu ceea ce se întâlneşte în cultura de calus. Pe secţiuni efectuate prin ţesutul tumoral sunt remarcate pachete traheale cu aspect globular sau arbuscular puternic ramificate alături de traheide izolate. Nodulii traheali sunt înconjuraţi de celule de tip parenchimatic aflate în stadii variate ale traheogenezei. Frecvenţa lor foarte mare permite monitorizarea modificărilor celulare succesive specifice fiecărei etape în parte ceea ce ne-a condus la aprecierea că şi acesta poate reprezintă un sistem experimental ideal pentru studiul apoptozei la plante neexploatat până acum. Pe plan ultrastructural sunt remarcate perturbări nucleare, în unele privinţe similare celor prezente în celula animală în decursul apoptozei, exprimate prin lobări şi fragmentări nucleare, număr mai mare de nucleoli, condensări ale cromatinei, o creştere a activităţii hipersecretoare a corpilor Golgi, etc, fără ca acestea să fie însoţiţe însă de formarea corpilor apoptotici tipici.

Datele prezentate aduc argumente în sprijinul ideii conform căreia traheogeneza reprezintă un sistem model pentru înţelegerea citodiferenţierii; în acelaşi timp, evidenţiază un mod particular de manifestare a MCP de tip apoptotic, la plante, înbinând caracterele generale specifice apoptozei în general cu elemente specifice plantelor. Între acestea menţionăm rolul esenţial al vacuomului dar şi implicarea căilor de semmnalizare auxinică asa numita “canalizare a fluxului de auxină” care are acţiune inductoare în realizarea patternului (pro-) vascular. Calea de semnalizare auxinică, implică printre altele şi calea proteolitică majoră,responsabilă de degradarea proteinelor, recuperarea de către plantă a aminoacizilor componenţi precum şi interventia Ca²⁺ cu rol esenţial în diferentierea elementelor traheale.

Top

HAPLOIDIA ŞI DIPLOIDIA LA PLANTE

Sorin Ştefănuţ

Institutul de Biologie Bucureşti, sorin.stefanut@ibiol.ro

Embriofitele au evoluat din algele de apă dulce de tipul characeelor. Ancestorii algali ai embriofitelor erau haploizi multicelulari, dar fără o fază diploidă multicelulară.

La embriofitele existente, trei mari categorii de cicluri de viaţă pot fi recunoscute. Acestea corespund grupărilor tradiţionale din botanică: briofitele, pteridofitele şi spermatofitelor (fig. 1). Din aceste grupări, numai spermatofitele sunt monofiletice. Pteridofitele sunt derivate din cadrul briofitelor, iar spermatofitele sunt derivate din cadrul pteridofitelor (Kenrick & Crane 1997).

Fig. 1. Alternanţa de generaţii la plante. a) Schema ciclului de viaţă la plante. b) Gametofitul haploid de la Polytrichum commune, un muşchi, cu doi sporofiţi diploizi. c) Gametofitul haploid de la Osmunda claytonia, o ferigă, cu un sporofit ataşat în tranziţie spre o existenţă independentă (Haig & Wilczek 2006) .

În ciclul de viaţă al briofitelor domină o fază multicelulară haploidă, iar după fecundare apare sporofitul diploid, dependent nutriţional de gametofitul matern. Sporofitul produce un sporangiu, unde are loc meioza în urma căreia apar sporii. După dispersia sporilor, sporofitul moare, dar gametofitul matern supravieţuieşte şi poate continua reproducerea asexuată sau sexuată.

În funcţie de poziţionarea organelor sexuale masculine şi feminine pe gametofitul de la briofite au fost descrise mai multe tipuri de relaţii mutuale, prezentate în fig. 2.

Mai mult de jumătate dintre speciile de musci şi peste două treimi dintre speciile de hepatice din întreaga lume sunt unisexuate (Wyatt 1982).

Fig. 2. Relaţiile mutuale dintre organele sexuale la plante (după Schuter 1969, modificată).

La briofite, speciile dioice rezultă din două tipuri de spori ce duc la formare a două tipuri de plante haploide (femele şi mascule). Plantele femele vor moşteni un singur cromozom X, iar plantele mascule vor avea un singur cromozom Y. Acestă situaţie nu este în analogie cu cea de la plantele superioare unde plantele femele vor moşteni câte doi cromozomi X, iar plantele mascule vor moşteni un cromozom X şi unul Y. La briofite, plantele diploide (sporofitul) sunt întotdeuna XY şi sunt asexuate (Fig. 3).

Fig. 3. Comparaţie dintre determinismul genetic al sexelor la plantele haploide şi diploide dioice (după Vitt 1968, modificată).

Top

Reţeaua Natura 2000 – modelul european pentru conservarea diversităţii biologice

Simona Mihăilescu

Institutul de Biologie Bucureşti, simona.mihailescu@gmail.com

Conservarea diversităţii biologice (biodiversităţii) tinde să devină una dintre cele mai importante paradigme ale ecologiei contemporane. În accepţia sa curentă, biodiversitatea a devenit sinonimă cu diversitatea componentelor taxonomice ale florei şi faunei unui teritoriu biogeografic. A devenit totuşi un uz larg de a defini biodiversitatea la nivelul genelor, speciilor, comunităţilor, precum şi ecosistemelor. În acelaşi timp, pe lângă diversitatea biologică structurală, s-au conturat cu pregnanţă aspectele funcţionale ale acesteia, concretizate în conceptul diversităţii funcţionale.

În România au fost ratificate principalele convenţii şi directive internaţionale cu privire la diversitatea biologică şi la conservarea ei şi se elaborează legislaţia de mediu în concordanţă cu legislaţia europeană în acest domeniu. Menţionăm, în mod special, Convenţia privind Diversitatea Biologică (Rio de Janeiro, 1992), care a fost ratificată prin Legea nr. 58/1994 şi Convenţia privind conservarea vieţii sălbatice şi a habitatelor naturale din Europa (Berna, 1979), adoptată prin Legea nr. 13/1993.

Reţeaua ecologică europeană Natura 2000

La nivelul Uniunii Europene au fost desemnate următoarele regiuni biogeografice şi marine: ALP=Alpine; ATL=Atlantic; BOR=Boreal; CON=Continental; MAC=Macaronesian; MED=Mediterranean; PAN=Pannonian; MATL=Marine Atlantic; MBAL=Marine Baltic; MMAC=Marine Macaronesian; MED=Marine Mediterranean. Numărul regiunilor biogeografice existente pe teritoriul fiecărui stat membru este foarte variabil. În comparaţie cu celelalte state membre, pe teritoriul României sunt prezente 6 regiuni (5 regiuni biogeografice şi una marină). În concluzie, România se află pe locul al-II-lea ca număr de regiuni biogeografice, după Franţa (7) şi la egalitate cu Spania (6).

Desemnarea reţelei Natura 2000 presupune identificarea speciilor de plante şi animale şi caracterizarea habitatelor pentru propunerile de situri Natura 2000, respectiv pentru:

- Situri de Importanţă Comunitară (SCI) – care au la bază Directiva Habitate a CE (Directiva 92/43/CEE a Consiliului Europei din 21 mai 1992 privind conservarea habitatelor naturale şi a speciilor de floră şi faună sălbatică - Council Directive 92/43/EEC on the Conservation of natural habitats and of wild fauna and flora).

-Arii de Protecţie Specială Avifaunistică (SPA) – care au la bază Directiva Păsări a CE (Directiva 79/409/CEE a Consiliului Europei din 2 aprilie 1979 privind conservarea păsărilor sălbatice - Council Directive 79/409/EEC on the Conservation of wild birds).

În 2007, prima evaluare sistematică a stării de conservare pentru cele mai vulnerabile tipuri de habitate şi specii protejate din Europa, în conformitate cu Directiva Habitate, a fost realizată ca parte a raportării regulate din 6 în 6 ani pentru 25 de state membre şi, respectiv, 11 regiuni biogeografice (7 terestre şi 4 marine). Acest exerciţiu de raportare la scară a fost incomparabil în Europa şi a stabilit o primă evaluare şi un punct de referinţă pentru a evalua tendinţele viitoare. La nivel european, rezultatele care acoperă perioada 2001-2006, arată că doar o mică parte a habitatelor şi speciilor de interes comunitar se află într-o stare favorabilă de conservare (aproximativ 15%).

Reţeaua Natura 2000 în România

Din punct de vedere al relevanţei faţă de reţeaua europeană, siturile Natura 2000 s-au desemnat în toate cele 6 regiuni biogeografice aflate pe teritoriul României (Alpină 22,75%, Continentală 53,63%, Panonică 6,02%, Stepică 16,85% şi Pontică 0,75%; regiunea Pontică-marină cuprinde zona de exclusivitate economică marină şi nu este încă calculată cu precizie). Bioregiunea stepică este prezentă la nivel de Uniune Europeană doar în România, iar regiunile pontică şi pontică-marină (Black Sea) sunt prezente în România şi Bulgaria.

Implementarea reţelei europene Natura 2000 în România implică un efort susţinut pentru întocmirea documentaţiilor ştiinţifice de fundamentare, corespunzătoare pentru includerea în sistemul european a siturilor desemnate la nivel naţional.

Cele două directive ale Uniunii Europene, respectiv Directiva Păsări şi Directiva Habitate, au fost transpuse în legislaţia românească prin Ordonanţa de Urgenţă a Guvernului României nr. 57 din 20/06/2007 privind regimul ariilor naturale protejate, conservarea habitatelor naturale, a florei şi faunei sălbatice. În anexele acestei ordonanţe a fost indicată prin (*) prioritatea de conservare a speciei sau habitatului.

Ca rezultat al aderării României la Uniunea Europeană în 2007, un număr de specii şi tipuri de habitate au fost propuse de ţara noastră pentru a fi incluse în anexele Directivei Habitate. Menţionăm speciile propuse a fi incluse în directivă: Romanichthys valsanicola Dumitrescu, Bănărescu, Stoica, 1957, Astragalus peterfii Jáv., Campanula romanica Savulescu, Centaurea pontica Prodan & E. I. Nyárád, Draba dorneri Heuffer, Galium moldavicum (Dobrescu) Franco, Moehringia jankae Griseb. ex Janka, Poa granitica Br.-Bl. ssp. disparilis (E. I. Nyárády) E. I. Nyárády, Potentilla emilii-popii Nyárády, Stipa danubialis Dihoru & Roman, Syringa josikaea Jacq. Fil. ex Reichenb., Tulipa hungarica Borbas. Menţionăm habitatele propuse a fi incluse în directivă: 31A0 * Izvoare termale din Transilvania acoperite de lotus (Transylvanian hot-spring lotus beds), 40C0 * Tufărişuri de foioase ponto-sarmatice (Ponto-Sarmatic deciduous thickets), 62C0 *Stepe ponto-sarmatice (Ponto-Sarmatic steppes), 91X0 * Păduri de fag dobrogene (Dobrogean Beech forests), 91Y0 Păduri dacice de stejar şi carpen (Dacian oak & hornbeam forests), 91AA * Păduri estice de stejar alb (Eastern white oak woods).

Reţeaua Natura 2000 în România este localizată pe întregul teritoriu aflat sub jurisdicţie naţională a României, inclusiv zona de exclusivitate economică marină, teritoriu pe care au fost desemnate siturile Natura 2000. Până în prezent s-au desemnat 273 SCI-uri şi 108 SPA-uri, consemnate în actele legislative: Ordin al Ministrului Mediului şi Dezvoltării Durabile nr. 1964/2008 privind instituirea regimului de arie naturală protejată a siturilor de importanţă comunitară, ca parte integrantă a reţelei ecologice europene Natura 2000 în România, şi respectiv, Hotărârea de Guvern nr. 1284/2007 privind declararea ariilor de protecţie specială avifaunistică ca parte integrantă a reţelei ecologice europene Natura 2000 în România. Prezentăm hărţi cu distribuţia la nivelul României a SCI-urilor şi SPA-urilor desemnate pentru reţeaua Natura 2000.

Selecţia siturilor Natura 2000 s-a făcut în baza unor criterii diferite pentru SCI sau SPA. În funcţie de clasificarea siturilor, măsurile de management sunt specifice şi definesc activităţile permise şi interzise în sit. Cu cât informaţia ştiinţifică rezultată în urma documentării din literatură şi a cercetărilor din teren este mai exactă, cu atât mai mult se poate ajunge la măsuri pentru menţinerea stării de conservare favorabilă necesară pentru speciile şi habitatele menţionate în anexele directivelor europene.

Top

Complexitatea biologică a rolului şi locului tisanopterelor în funcţie de etajarea vegetaţiei

Liliana Vasiliu-Oromulu

Institutul de Biologie Bucureşti, liliana.oromulu@ibiol.ro

Învelişul vegetal reprezintă mozaicul comunitǎţiilor de plante care acoperǎ un anumit teritoriu. În România, acesta prezintǎ urmǎtoarele unitǎţi zonale pe latitudine: zona de stepǎ, silvostepǎ, a pǎdurilor de foioase şi pe altitudine, în teritoriul deluros-muntos: etajul nemoral, boreal, subalpin şi alpin.

În fiecare unitate de vegetaţie sunt menţionate flora şi fauna caracteristicǎ la nivel macro al complexitǎţii biologice, iar la nivel micro, sunt citate insectele din ordinul Thysanoptera, în distribuţia lor altitudinală de la 2500 m pânǎ la nivelul Mǎrii Negre (pe baza literaturii publicate între 1900-2009).

În Masivele Gârbova, Bucegi, Retezat, Piatra Craiului, aceste insecte prezintă maximul diversităţii în etajul nemoral al pǎdurilor de foioase (85 specii). Există şi o delimitare caracteristică: doar în zona alpină se gaseşte Apterothrips secticornis. In stepa Dobrogeană, din cele 67 specii semnalate, tipic este thripsul Chirothrips spinulosus, iar pentru zona Marii Negre, Oxythrips euxinus.

Sunt 11 specii ubicviste, prezente din stepa Dobrogeană pâna la Vf. Omu.

Ca urmare a impactului antropic au loc schimbări importante ale complexităţii biologice, atât la nivel macro, asupra florei şi faunei, cât şi la nivel micro, asupra thysanopterelor, determinând diminuarea accentuată a diversităţii specifice şi densităţii acestora.

Top

COMPLEXITATEA INTERRELAŢIILOR DINTRE PLANTE ŞI INSECTELE FITOFAGE

Sanda Maican

Institutul de Biologie Bucureşti, sanda.maican@ibiol.ro

Plantele (producătorii primari) sunt principalele organisme capabile să sintetizeze substanţe organice pornind de la substanţe anorganice, prin captarea energiei solare cu ajutorul pigmenţilor clorofilieni, în cadrul procesului de fotosinteză. Substanţa organică acumulată în corpul plantelor este consumată de organismele fitofage, inclusiv de insecte (consumatorii primari), de la aceştia fiind transferată celorlalte categorii de consumatori.

Coevoluţia plante-insecte fitofage

Atunci când două tipuri de organisme interacţionează unul cu celălalt (un prădător cu prada lui, o gazdă cu parazitul ei, o plantă cu flori cu un polenizator), fiecare dintre parteneri va exercita o presiune selectivă asupra celuilalt. Diversitatea şi răspândirea actuală a plantelor şi insectelor este rezultatul coevoluţiei lor, o mare parte a procesului de evoluţie desfăşurându-se printr-o astfel de coevoluţie.

Coevoluţie = dezvoltarea unor adaptări complementare la două categorii de organisme, determinată de acţiunea de selecţie pe care o exercită reciproc una asupra celeilalte.

Răspândirea impresionantă a angiospermelor s-a produs în Cretacic, cu cca. 125 milioane de ani în urmă, concomitent cu o răspândire similară a insectelor. Acest fenomen, numit de Darwin “enigma revoltantă” s-a datorat polenizării încrucişate realizate de către insecte, unirea gameţilor de la plante diferite din aceeaşi specie ducând la creşterea vitalităţii, rezistenţei şi productivităţii descendenţilor. În prezent, cca. 80% dintre plantele cu flori sunt entomofile.

Iniţial, interrelaţia dintre insecte şi plantele cu flori a constat în consumul organelor florale de către insecte - relaţie cu profit unilateral. Ulterior, aceasta a evoluat către o relaţie de simbioză, cu profit bilateral, la avantajul trofic al insectelor adăugându-se cel al polenizării încrucişate pentru plante.

Fitofagia

Este o relaţie trofică foarte răspândită în lumea insectelor. Insectele fitofage se hrănesc atât cu organele aeriene (frunze, ramuri, lemn şi scoarţa tulpinilor, flori, fructe, seminţe) şi subterane ale plantelor vii (rădăcini, tuberculi, rizomi, bulbi), cât şi cu lemnul mort. Poate fi fitofag doar unul dintre stadii (larva sau adultul) sau ambele stadii, hrănindu-se cu acelaşi organ sau cu organe diferite ale plantei.

Ponderea speciilor de insecte fitofage în cadrul diferitelor grupe de insecte.

Ordinele Coleoptera şi Lepidoptera includ cel mai mare număr de specii fitofage, în contrast cu Ordinul Orthoptera, cu cel mai mic număr de specii fitofage.

Specializarea insectelor fitofage.

a) în funcţie de numărul speciilor de plante pe seama cărora se hrănesc, insectele fitofage se clasifică în: monofage, oligofage şi polifage.

§ monofage - insecte strict specializate pe o singură specie de plantă;

§ oligofage - se hrănesc cu un număr mic de specii de plante, aparţinând unei singure familii;

§ polifage - se hrănesc cu un număr relativ mare de plante din familii diferite (exemple).

Dintre cele aprox. 310.000 specii de insecte fitofage, peste 230.000 (cca. 75%) sunt mono- sau oligofage.

Fenomenul de acceptare a unei plante refugiu este întâlnit la multe specii de insecte (ex: Chrysomelidae) din ţările temperate şi tropicale, în perioade de secetă, când are loc dispariţia sezonieră a plantei gazdă; se manifestă prin atracţia adulţilor pentru specii de plante care nu sunt în mod normal plantele gazdă tipice pentru aceştia.

b) după părţile plantelor pe care le consumă, insectele fitofage pot fi:

§ filofage (frunze);

§ seminifage (seminţe);

§ xilofage (lemn);

§ rizofage (rădăcini);

§ polinivore (polen);

§ nectarivore (nectar).

Mutualismul

Relaţia dintre insectele antofile şi plantele entomofile - relaţie bilateral benefică, care a mers până la o dependenţă strictă a plantelor entomofile de insectele polenizatoare (antofile).

§ insecte antofile (gr. anthos = floare + philein = iubitor) - insecte care vizitează florile, realizând polenizarea încrucişată;

§ plante entomofile (gr. entomon = insectă + philein = iubitor) - plante care prezintă adaptări speciale (nectar, polen, parfum, culoare) pentru a atrage insectele care le asigură polenizarea (exemple).

Mecanisme de apărare ale plantelor faţă de insectele fitofage

În cursul coevoluţiei, plantele şi-au dezvoltat prin selecţie naturală, o serie de mecanisme de apărare (fizice, chimice) faţă de atacul insectelor.

Mecanisme fizice - sunt reprezentate de: lignificarea unor organe, prezenţa pubescenţei, a

spinilor, perilor urticanţi (exemple).

Mecanisme chimice - extrem de complexe, acţionează asupra insectelor fitofage la nivel

comportamental, determinând inhibarea hrănirii, dar şi la nivel fiziologic, putând conduce la: intoxicarea insectelor, reducerea eficienţei procesului de hrănire, scăderea rezistenţei faţă de acţiunea patogenilor, inducerea unor anomalii în dezvoltare (ex: producerea de către unele plante a hormonilor care controlează metamorfoza insectelor - hormoni de năpârlire, ecdisoni).

Metaboliţii secundari (taninuri, cumarine, alcaloizi etc.) sunt compuşi toxici secundari produşi

de plante care nu intervin neapărat în metabolismul primar, dar care constituie factorul selectiv ce conferă plantelor protecţie contra insectelor.

Mecanisme de apărare ale insectelor fitofage faţă de plante

Insectele fitofage reacţionează faţă de mecanismele chimice defensive ale plantelor prin diferite mecanisme de apărare: detoxifierea substanţelor toxice, depozitarea acestora în corp - insectele devenind la rândul lor toxice pentru duşmanii naturali, excreţia (exemple).

Bazele fizice şi chimice ale selecţiei plantelor de către insectele fitofage

Percepţia vizuală – factor de selecţie.

Adulţii gândacilor-de-frunze (Chrysomelidae), spre deosebire de formele larvare, disting culorile. În mod normal, culoarea verde este cea mai stimulantă, deoarece ea corespunde culorii frunzelor care sunt consumate cu prioritate. Speciile de Chrysolina pot distinge albastru de galben, portocaliul de violet şi de verde. Culoarea şi forma plantei intervin în mod egal în procesul de selecţie, mai ales la arbuşti.

Categorii de compuşi chimici care intervin în procesul de selecţie al plantelor gazdă:

§ arestanţi - stopează locomoţia;

§ atractanţi - determină orientarea şi mişcarea către sursa de hrană;

§ inhibitori ai hrănirii - resping insecta şi împiedică consumul plantei;

§ fagostimulanţi - declanşează şi favorizează hrănirea.

Top

COMPLEXITATEA BIOFILMELOR MICROBIENE LA NIVEL MACRO, MICRO, NANO

Prof. dr Veronica Lazar

Universitatea Bucureşti, Facultatea de Biologie

Biofilmele microbiene, mono- sau polispecifice (consortii), sunt considerate o fază de creştere distinctă, o formă de diferenţiere celulara primitiva a bacteriilor, ca si a altor microorganisme unicelulare, fiind profund diferite de forma alternativa de existenta, de celule libere, planctonice, studiate atat de intens in perioada postpasteuriana; aceasta stare confera celulelor componente o serie de avantaje si in general o capacitate mai mare de adaptare si rezistenta la orice forma de stres. Observatiile directe asupra bacteriilor prezente in toate ecosistemele naturale au aratat in mod constant ca aceste organisme predomina sub forma unor comunitati inalt structurate denumite "biofilme", asociate cu diferite suprafete (animate si neanimate). De altfel, in mediul natural doar in aceasta stare microorganismele sunt accesibile observatiei macroscopice; microscopia insa a fost şi continuă să fie o metodă primară de studiu a populaţiilor microorganismelor ataşate. Se afirmă că se poate vorbi de un biofilm la densităţi variind între de 10⁴celule/cm²–10⁸celule/cm², aceste limite marcând diferenţa dintre biofilmele invizibile şi cele vizibile, dintre microscopic si macroscopic.

Un biofilm este definit in prezent ca fiind o comunitate microbiană sesilă compusă din celule care sunt în mod ireversibil ataşate la un substrat, la o interfaţă sau unele de altele, care sunt înglobate într-o matrice de substanţe polimerice extracelulare produse de către aceste celule şi care prezintă un fenotip modificat, în privinţa ratei de creştere şi a transcrierii genelor.

La sfarsitul anilor '80 utilizarea de tehnici nedistructive, cum ar fi microscopia laser confocala cu baleiaj si microelectrozii au adus o imagine mai precisa asupra structurii biofilmelor.Un biofilm matur este multistratificat si prezinta o arhitectura complexa, fiind asemanator cu o structura tisulara, prezentand astfel si o importanta evolutiva. Celulele biofilmului beneficiaza de o <<homeostazie>> primitivă, <<un sistem circulator>> primitiv şi o cooperare metabolică, particularităţi care fac ca aceste celule sesile să difere fundamental de celulele planctonice din aceeaşi specie. Biofilmele care se dezvoltă pe suprafeţe solide expuse unui curent continuu de nutrienţi, formează structuri diferenţiate în «ciuperci» şi «coloane» formate din substanţe polimerice extracelulare şi celule înglobate, separate de spaţii scăldate de lichid. Aceste structuri, destul de rezistente, pot totuşi să fie uneori detaşate de curenţi şi să realizeze diseminări la distanţă. Trecerea de la stadiile iniţiale ale colonizării, către forme stabile în biofilme mature implică interacţiuni nu numai cu substratul, ci şi între celule. Rezultatele studiilor la nivel molecular asupra biofilmelor au demonstrat ca acestea se formeaza datorita unor procese controlate de mecanisme complexe de semnalizare intercelulara si ca reglajul genetic in timpul dezvoltarii biofilmului este dependent de acumularea unor molecule semnal cu rol in comunicarea intercelulara, cu g.m. mica: acizi graşi volatili, peptide si homoserin-lactone. Studii recente afirmă rolul determinant al unui proces tipic de detectare a densităţii celulare (quorum sensing and response) asupra arhitecturii şi rezistenţei biofilmelor la condiţii de stres, asupra exprimarii/represiei unor gene, 40-60 % din genomul procariot fiind supus unei noi programari, in celulele bacteriene ireversibil aderate la diferite substraturi. Descifrarea mecanismelor moleculare ale reglării, ar putea constitui premisa manipularii procesului în sensul dorit: ataşare/detaşare.

Aceste organisme sesile predomină în majoritatea mediilor naturale, dar fiziologia şi comportamentul lor sunt de mare interes şi pentru domeniile industrial şi medical. Formarea de biofilme în mediul natural şi în sistemele industriale este considerată în prezent ca una din strategiile de adaptare şi supravieţuire ale bacteriilor, pentru protecţia faţă de substanţe antibacteriene (incluzând şi antibibioticele naturale), faţă de bacteriofagii şi protozoarele bacteriovore din mediu. În acest context, este explicabil faptul că infecţiile cronice determinate de bacterii crescute în biofilme sunt rezistente la antibioterapie, ca şi la mecanismele de clearance, de îndepărtare a substanţelor străine din organismul gazdei, cum ar fi anticorpii şi fagocitele. In "ecosistemele" medicale, aderenta microbiana conduce la formarea de biofilme pe diferite suprafete, naturale (tegumente si mucoase, intacte sau lezate, celule endoteliale, dinti) sau artificiale (diferite materiale protetice) si reprezinta o preconditie in patologia a numeroase infectii bacteriene, dificil de tratat, datorita comportamentului diferit al celulelor din biofilme, respectiv rezistentei fenotipice, comportamentale sau, mai nou, tolerantei fata de factori antimicrobieni.

In domeniul biotehnologiei, se utilizeaza în prezent biofilme şi celule imobilizate cu scopul de a creşte performanţa bioreactoarelor, deoarece este demonstrat faptul că microorganismele imobilizate realizează activităţi care sunt mai diverse, mai eficiente şi mai importante din punct de vedere economic decât ale celor aflate în stare libera, pentru a obţine metaboliţi specifici acestei faze de creştere sau pentru a realiza bioconversia unor substante greu biodegradabile, ca şi pentru crearea de biosenzori, deoarece există posibilitatea localizării unui răspuns biologic. Dintre structurile suprafatei celulare care mediaza aderenta denumite generic adezine, stratul S, reprezentat de două straturi proteice paracristaline, una dintre cele mai primitive structuri parietale, este obiectul unor cercetari intense in prezent; cunoştinţele actuale asupra structurii, compoziţiei chimice, asamblării, proprietăţilor de permeabilitate ale proteinelor (glicoproteinelor) acestui strat au condus deja la spectru larg de aplicaţii, atât biotehnologice, biomedicale, cât şi în domeniul nanotehnologiilor, care vor permite de exemplu, «creşterea» miniaturizării senzorilor bioanalitici şi a dispozitivelor bioelectronice.

Ca o stare alternativă a populaţiei, agregarea celulară contribuie la supravieţuirea comunităţii într-un mediu ostil. Avantajele care decurg din organizarea microorganismelor într-un aranjament "social" pot fi imaginate prin analogie: ceea ce nu poate fi realizat de indivizi, poate fi atins de o uniune sinergică a mai multor indivizi. Capacitatea de aderenţă a microorganismelor are o origine foarte veche, aşa cum o demonstrează prezenţa biofilmelor în stromatolitele fosilizate. Din punct de vedere teoretic, agregarea microbiană în general a fost folosită ca model de studiu pentru alte fenomene biologice care implică interacţiunea celulă - celulă, cum ar fi diferenţierea, morfogeneza, sexualitatea, comunicarea, recunoaşterea, reglarea, specificitatea macromoleculară. Recunoaşterea în ultimele decenii a semnificaţiei ecologice, medicale si biotehnologice, ca si teoretice a fenomenelor de aderenţă şi agregare microbiană ce conduc la formarea de biofilme a determinat o escaladare a cercetarilor în acest domeniu, pe deplin justificată.

Top

RELAŢIILE TROFICE ALE COMUNITĂŢILOR PLANCTONICE ÎN ECOSISTEME DE TIP LACUSTRU

Victor Zinevici, Laura Parpală

Institutul de Biologie Bucureşti, victor.zinevici@ibiol.ro; laura.parpala@ibiol.ro

Planctonul reprezintă comunitatea pelagică alcătuită din organisme care plutesc pasiv în masa apei graţie unor adaptări semnificative sau care execută deplasări limitate cu ajutorul unor organe destinate doar parţial scopului menţionat, rolul principal al acestora fiind acela de filtrare sau sedimentare a particulelor mărunte aflate în suspensie, dintre care o parte prezintă importanţă în procesul de hrănire.

Termenul de plancton a fost utilizat pentru prima dată de Hensen (1887), dar într-o accepţie diferită de cea actuală, ce grupa laolaltă atât particulele vii, cât şi cele de natură detritică sau minerală.

Structura trofică a planctonului este alcătuită din mai multe nivele reunite schematic sub forma unei piramide. La baza acesteia se află producătorii primari, componente cu rol esenţial în introducerea masei şi energiei în ecosistem; vârful piramidei este constituit din consumatorii de ordinul I cunoscuţi sub numele de zooplancton nonpredator, „ierbivor” sau „paşnic” şi cei de ordinul II, zooplanctonul predator, în timp ce între producătorii primari şi consumatori se localizează descompunătorii.

Producătorii primari sunt reprezentaţi în mod prioritar de fitoplancton şi complementar de cianobacterii. În structura fitoplanctonului se întâlnesc populaţii de euglenoficee, dinoficee, criptoficee, crisoficee, xantoficee, bacilarioficee şi cloroficee. Consumatorii primari sunt reprezentaţi de testacee, ciliate, rotifere, larve planctonice de lamelibranhiate, cladocere şi copepode „ierbivore”, iar cei secundari – de ciliate, rotifere, cladocere şi copepode predatore.

Producătorii planctonici pot fi valorificaţi în mod direct de către consumatorii planctonici primari sau sub formă indirectă, prin intermediul canalului trofic al hranei detritice.

În bazinele caracterizate prin nivele ridicate de trofie, biomasa totală a algelor de talie mare, ce nu pot fi reţinute cu aparatura de captare a hranei de către zooplancton, o întrece pe cea a algelor nanoplanctonice, utile hranei acestora. După moarte, algele neconsumate sunt atacate de populaţii bacteriene şi fragmentate în particule detrito-bacteriene mărunte, ce reprezintă o sursă importantă de hrană pentru zooplancton.

Structura trofică a zooplanctonului relevă existenţa unei organizări complexe pe nivele, tipuri şi grupe trofice. Între componentele nivelelor se desfăşoară relaţii trofice bazate pe transfer de materie organică şi energie. În cazul componentelor aceluiaşi nivel, integrate în tipuri sau grupe distincte, accesul la hrană se realizează prin specializare în captarea unei game distincte de particule, sub raport dimensional. În fine, între componentele aceleiaşi grupe se desfăşoară relaţii de tip competitiv.

În majoritatea cazurilor selectarea hranei zooplanctonului se realizează în mod pasiv, în funcţie de dimensiunile reţelei aparatului filtrator sau de cele ale orificiului de captare a hranei. În schimb, calitatea nutritivă şi gustativă a particulelor sau originea acestora prezintă de obicei importanţă redusă sau nulă. O oarecare excepţie de la această situaţie prezintă doar copepodele. În funcţie de dimensiunile hranei ingerate, consumatorii primari se diferenţiază în două tipuri trofice: microconsumatori şi macroconsumatori. Primii se hrănesc prioritar cu agregate detrito-bacteriene, complementar cu nanofitoplancton mărunt, iar ceilalţi, prioritar cu nanofitoplancton de talie mare, complementar cu agregate detrito-bacteriene.

În structura tipului microconsumator se evidenţiază cinci grupe trofice (microfagotrofi, microsedimentatori, microfiltratori-sedimentatori, microfiltratori „eficienţi” şi microfiltratori „ineficienţi”, iar în cea a tipului macroconsumator, două – macrofiltratori – secundar predatori şi macrofiltratori propriu-zişi.

Cel de al doilea nivel trofic include consumatorii secundari diversificaţi în trei grupe trofice: predatori-secundar microsedimentatori, predatori-macrofiltratori şi predatori propriu-zişi.

În ansamblul complexelor relaţii interspecifice, cele de natură trofică constituie principalul mecanism al funcţiei de autocontrol ecosistemic.

Modificările ample, intervenite în ultimile decenii ale secolului 20 în structura şi funcţiile zooplanctonului lacustru din Delta Dunării (reducerea semnificativă a spectrului taxonomic, proliferarea numerică, creşterea evidentă a biomasei şi productivităţii, scurtarea timpului de reciclare a biomasei, ca şi schimbările sesizate la nivelul populaţiilor şi asociaţiilor sale dominante) constituie, într-o măsură însemnată, rezultanta mutaţiilor intervenite în structura şi relaţiile trofice ale consumatorilor planctonici cu componentele celorlalte nivele trofice ale comunităţilor planctonice şi în primul rând cu producătorii primari.

Top

ANTICORPI CONJUGAŢI CU NANO-PARTICULE DE AUR COLOIDAL CU UTILIZARE ÎN DETECTAREA UNOR MOLECULE DE INTERES ÎN BIOLOGIE ŞI MEDICINĂ

Mirancea N., Mirancea Dorina

Institutul de Biologie Bucureşti, nicolae.mirancea@ibiol.ro

Toate entităţile şi infrastructurile subcelulare intră în categoria de mărimi cuprinse în scala nanometrică de aproximativ sub un nanometru până la câteva sute de nanometri. Obiectele de studiu ale biologiei moleculare sunt în principal ADN-ul, ARN-ul şi proteinele. Diametrul dublului helix al ADN-ului are cca. 2 nm, diametrul unei proteine tipice cum este hemoglobina masoară cca. 5 nm, placa desmozomală are cca. 30 nm, iar joncţiunea hemidesmozomală este aproximată la 200 nm.

Într-o exprimare concisă, nanotehnologia poate fi definită ca fiind inovaţia umană în controlul structurilor şi proceselor incluse în scala nanometrică.

Localizarea spaţio-temporală a proteinelor la nivel celular/tisular este în principal realizată prin microscopia optică (M.O.). Pentru vizualizare, microscopia optică foloseşte lumina (fotonii). Rezoluţia în microscopie creşte atunci când în locul fotonilor sunt utilizaţi electronii (microscopia electronică), întrucât diferit de fotoni, electronii au lungimea de undă (0.004 nm) de cinci ori mai scurtă decât lumina vizibilă. Condiţia esenţială pentru ca un agent utilizat ca marker să fie detectabil (vizibil) în microscopia electronică în transmisie (MET) este ca acesta să aibă o greutate moleculară capabilă la impactul cu fluxul electronic să determine împrăştierea (scatter) electronilor încât, la examinarea în MET markerul este vizualizat ca o zonă mult mai electronodensă (eventual ca un semnal electrono-opac) decât restul imaginii înregistrate.

Investigarea unor molecule (proteine, glicoproteine etc.) in situ, cu ajutorul microscopului electronic (ME) utilizând anticorpi conjugaţi cu aur coloidal (imuno electronomicroscopie – IEM) oferă posibilitatea de a localiaza molecule de interes pe/în infrastructurile celulare sau din matricea extracelulară şi de a face aprecieri în legătură cu geometria distribuţiei unor molecule în raport cu altele la nivelul scalei nanometrice. În cazul în care este necesară identificarea in situ a unor secvenţe specifice de acizi nucleici (ADN sau ARN) în celule izolate sau chiar în ţesuturi la înaltă rezoluţie, atunci se aplică tehnica de hibridizare in situ la nivel ultrastructural (ISH-EM). Dacă pentru aceeaşi probă biologică (celule, ţesuturi) se aplică o combinaţie de IEM şi ISH-EM, atunci se pot obţine informaţii topologice privind activitatea genelor la nivelul ADN-ului, ARNm precum şi al produselor activităţii genelor – proteinele.

În scopul detectării unor secvenţe de acizi nucleici la nivel ultrastructural, (ISH-EM), se utilizează cu succes digoxigenina (un steroid izolat din plante Digitalis purpurea sau Digitalis lanata care se leagă la nucleotida uridină) şi un anticorp anti-digoxigenină cuplat cu particule de aur coloidal de diferite dimensiuni (1, 5, 10, 15 nm). Întrucat singurele surse naturale de digoxigenină sunt florile şi frunzele speciilor de plante mai sus menţionate, nu apare nici o legare nespecifică a anticorpilor anti-digoxigenina în alte materiale biologice.

O modalitate elegantă de a realiza ISH-EM este utilizarea unui Peptid Nucleic Acid (PNA) care este un ADN sintetic în care scheletul fosfat-deoxiriboza este înlocuit printr-un schelet peptidic la care sunt legate nucleobazele. Dacă la o secvenţă de baze nucleotidice de tip PNA cunoscută se cuplează digoxigenina, după realizarea protocolului de ISH-EM care presupune şi utilizarea unui anticorp anti-digoxigenină cuplat cu aur coloidal, se poate localiza in situ cu precizie gena de interes.

Recent, nanocristale semiconductoare mici cunoscute si sub numele de quantum dots (QDs) făcute din selenit de cadmiu sau materiale înrudite au fost optimizate în aplicarea lor în cercetarea biologică bazată pe observaţii de microscopie optică. QDs sunt nanoparticule semiconductoare anorganice fluorescente cu proprietăţi optice superioare fluoroforilor organici.

Existenţa strâns-împachetată a atomilor în miezul şi învelişul acestor nanocristale le face să fie în bună masură şi markeri potenţiali pentru proteine la nivel electronomicroscopic (EM).

QDs sunt atât fluorescente cât şi electronodense, ceea ce facilitează utilizarea lor în analiza de microscopie corelativă.

Conjugate cu aur coloidal de 1nm

Majoritatea proteinelor (în principal imunoglobuline) utilizate pentru legare cu aur coloidal au mărimea cuprinsă între 5-10 nm. O imunoglobulină IgG cu o greutate moleculară de 150.000 are aproximativ 8 nm lungime. Când sunt adsorbite particule de aur coloidal de o mărime echivalentă sau mai mare decât imunoglobulina IgG, (de exemplu mai mare de 5 nm), asemenea proteine pot fi îndeajuns alterate încât să le afecteze reacţia lor de legare (steric hindrance). În plus, afinitatea şi aviditatea legării poate fi afectată atât ca urmare a ordinului de mărime cât şi al încărcării electrice a particulelor de aur. Asemenea particule de aur coloidal mari pot să prevină penetrarea anticorpilor prin membrane şi marcarea unor componente intracelulare. Când anticorpii şi proteinele sunt acoperite cu particule de aur de 1 nm, multe dintre aceste dificultăţi sunt depăşite. Întrucât o particulă de aur de 1 nm este mai mică decât o moleculă de anticorp, mai mult de o particulă se pot ataşa de fiecare imunoglobulină. Se estimează că până la 3 particule de aur de 1 nm pot să se lege de gruparea Fc a unei IgG.

Un mare avanataj al particulelor de aur de 1 nm este acela al creşterii penetrării anticorpilor în celule şi ţesturi fără a fi nevoie de o permeabilizare extensivă, ştiut fiind că permeabilizarea cu detergenţi poate să determine alterări severe sau pierderea unor constituienţi intracelulari. Deşi tratamentul celulelor şi ţesuturilor cu detegenţi cum ar fi Triton-X sau saponină permite anticorpilor să ajungă la antigenii citosolici, aceşti detergenţi tind să rupă membranele şi componentele citoscheletice. Sunt două raţiuni pentru care detergenţii ar trebui omişi: 1) detergenţii alterează ultrastructura membranelor; 2) detergenţii pot să disloce proteinele legate la membrane. Anticorpii primari cuplaţi cu particule de aur coloidal de 1 nm, penetrează celulele şi ţesuturile fără tratament cu detergent. In Imuno-EM, validitatea acestei afirmaţii este probată prin utilizarea metodei de pre-embedding comparativ cu imunomarcarea utilizând secţiuni ultrafine post-embedding. Pentru a identifica antigenii celulari/tisulari recunoscuţi de anticorpii cuplaţi cu aur coloidal de 1 nm prin IEM la magnificaţii rezonabile, înainte de contrastarea secţiunilor ultrafine, este necesară aplicarea unui protocol de amplificare a semnalului cu argint (silver enhancement) prin care, în funcţie de durata reacţiei de amplificare, obţinem granule electronoopace de dimensiuni controlate.

Conjugate cu nanogold^®

Particula nanogold^® este covalent şi specific legată la o grupare „balama” tiol pe Fab´ sau IgG. Comparativ cu preparatele de anticorpi cuplate cu aur coloidal, conjugatele nanogold^® au o excenlentă stabilitate. Conjugaţii cu nanogold^® pot fi utilizaţi: în microscopia electronică pe criosecţiuni ultrafine, în microscopia electronică pre-embedding, în microscopia electronică post-embedding, în microscopia electronica cu baleiaj (SEM), în microscopia corelativă TEM-MO- microscopie confocală.

Nanogold^®este un marker foarte bun. Particula de nanogold^® de 1,4 nm este un compus de aur care nu este doar adsorbit la proteină aşa cum e cazul aurului coloidal ci, în condiţii de tamponare medie, reacţionează covalent la locuri specifice. Nanogoldul^® marchează numai la locurile reactive specifice. Marcarea este selectivă pentru tiol (reziduuri de cisteină) sau amine primare (N-terminal, reziduuri de lisină). Semnalul prezenţei particulelor nanogoldului^® de 1,4 nm poate fi amplificat prin autometalizare cu argint: o expunere scurtă de câteva minute (1-5 minute) le fac vizibile la nivel electronomicroscopic sub forma unor granule de circa 2-20 nm, depinzând de timpul de developare. O developare prelungită (8-25 minute) provoacă un semnal de culoare neagră uşor de detectat în microscopia optică, în imunoblotting (Western blot sau Southern blot). Conjugatele nanogold^® penetrează/difuzează uşor în ţesuturi, în celule şi nucleii acestora. Deşi particulele de nanogold^® de 1,4 nm pot fi vizualizate direct la o magnificaţie de circa 100.000 chiar pe secţiuni groase de 80 nm (secţiuni necontrastate), totuşi acestea sunt mai uşor vizualizate după o scurtă amplificare cu argint (1-5 minute).

Importanţa utilizării anticorpilor conjugaţi cu aur coloidal în biologie şi medicină

Utilizarea anticorpilor conjugaţi cu aur coloidal, în special în IEM, face posibilă cunoaşterea interrelaţiilor structură-funcţie la nivel subcelular. Identificarea concomitentă a două sau trei molecule de interes pe aceeaşi secţiune provenită dintr-un specimen biologic normal sau patologic, permite evaluarea la nivel ultrastructural a topologiei acelor molecule investigate. IEM este deosebit de utilă în cazul în care se doreşte investigarea proceselor receptor-mediate, al traficului unor molecule care implică diferite infrastructuri celulare etc. Utilizarea concomitentă a IEM şi ISH-EM oferă informaţii pertinente de cunoaştere a relaţiilor subtile dintre gene şi produşii lor la nivel celular. Având în vedere existenţa pe piaţă a unei multitudini de anticorpi conjugaţi cu aur coloidal capabili să identifice diverse molecule implicate în declanşarea sau susţinerea unor maladii, aplicaţiile IEM sau IEM plus ISH-EM în patologie pot contribui fundamental la stabilirea diagnosticului şi, în acord cu acesta, la evaluarea protocoalelor terapeutice.

Top

BUCLĂ MICROBIANĂ - MODEL DE EFICIENTIZARE AL FLUXULUI DE MATERIE ŞI ENERGIE ÎN ECOSISTEME ACVATICE

Doina Ionică, Mirela Moldoveanu

Institutul de Biologie Bucureşti, doina.ionica@ibiol.ro

Abordarea modernă în ecologia sistemică presupune cercetări de lungă durată, la scară spaţio-temporală, a ecosistemelor integrate ierarhic în sistemul global - ecosfera.

Deşi, furnizarea de resurse şi servicii este o proprietate emergentă a ecosistemelor, realizarea funcţiilor ecologice se bazează pe contribuţia directă sau indirectă a multor specii/populaţii/ghilde/module trofo-dinamice. Procesele ecologice susţinute de specii/populaţii realizează legătura dintre diversitatea biologică şi resursele/serviciile generate la nivelul ecosistemelor.

Ecologia microorganismelor nu este un aspect periferic ci unul central al ecologiei. Microorganismele au o largă distribuţie în orice tip de ecosistem iar transformările microbiene sunt fundamentale pentru ecosfera. Microorganismele generează modificarea continuă a nişelor unui ecosistem care sunt permanent ocupate, astfel încât, diversitatea microbiană rămane o componentă permanentă a funcţionării ecosistemului (Finlay,1997).

Pentru a caracteriza funcţionalitatea unui ecosistem în termeni de flux de materie, energie, informaţie şi cicluri biogeochimice, microorganismele trebuie luate obligatoriu în considerare. Ecologia microorganismelor este strâns legată de ecologia macroorganismelor iar, abordarea de tip holist impune studiul lor integrat în structurile ecologice ierarhice.

Semnificaţia buclei microbiene a fost unanim recunoscută atât în ecosistemele marine cât şi în cele de apă dulce (Azam et. al, 1983; Pomeroy, 1974). Wetzel a descris bucla ca model al căilor de transfer al carbonului şi de ciclare a nutrienţilor prin componentele microbiene ale comunităţilor acvatice pelagice.

Bucla microbiană constituie astfel, o cale structurală şi funcţională în cadrul reţelei trofice în care carbonul organic dizolvat (COD) este returnat nivelelor trofice superioare via incorporării în biomasa bacteriană.

Bucla microbiană procesează 33-50% din producţia primară fiind o secvenţă ce implică COD – bacterii – nanoflagelate heterotrofe – ciliate – mezozooplancton. Prin acesta din urmă, reţeaua microbiană este interconectată şi paralelă cu reţeaua trofică clasică, reprezentată de fitoplancton - mezozooplancton – peşti.

Odată cu dezvoltarea tehnicilor moderne de investigare a populaţiilor bacteriene, epifluorescenţa şi FISH, s-a remarcat numărul mare al acestora (10⁶- 10⁹), precum şi funcţionarea lor nu numai ca descompunători, ci şi ca producători prin producţia şi cantitatea de energie acumulată în biomasa proprie şi transferul acesteia spre nivele trofice superioare.

Procesele desfăşurate la nivelul buclei microbiene sunt strâns dependente de tipul de ecosistem acvatic, de condiţiile fizico-chimice ale sistemului, de stadiul trofic al acestuia.

Stabilirea configuraţiei reţelei trofice ale unui ecosistem aflat în stadii succesionale diferite se realizează în sensul maximalizării densităţii fluxului de energie şi a eficienţei de utilizare, concentrare şi transfer a energiei din biomasa producătorilor primari. În stadii de eutrofie şi hipertrofie coexistă trei tipuri de lanţuri trofice interconectate într-o reţea heterogenă în care bucla microbiană procesează cantităţi importante de energie conţinută în detritus, contribuind astfel la deblocarea sistemului (lacuri eutrofe din Delta Dunării, sisteme poluate, ape tropicale).

În condiţii de oligotrofie (mari, oceane, lagune, lacuri alpine, sisteme lotice), la nivelul buclei se transferă atât substanţe organice către nivelele trofice superioare eficientizându-se calea de transfer microbiană a energiei, dar în acelaşi timp susţinând productivitatea primară destul de scăzută de altfel, prin punerea rapidă la dispoziţie de cantităţi importante de nutrienţi fitoplanctonului.

Monitorizarea integrată a microorganismelor pelagiale din ecosistemele acvatice constituie un instrument important în evaluarea schimbărilor structurale şi funcţionale de nivel ecosistemic care se reverberează la nivelul sistemului global, Ecosfera.

Top

STRUCTURI MICROBIENE EXTRAPARIETALE CU IMPLICATII PRACTICE

Anca Voicu

Institutul de Biologie Bucureşti, anca.voicu@ibiol.ro

Numeroase organisme procariote sunt înconjurate la suprafaţă de o matrice de material cu consistenţă mucoasă, gelatinoasă. Capacitatea de a sintetiza exopolizaharide se întâlneşte la peste 70 de genuri şi specii de microorganisme, din rândul bacteriilor, levurilor, fungilor şi microalgelor, manifestată diferenţiat în funcţie de specie, condiţii de mediu şi precursori.

Interesul ştiinţific şi practic pentru cercetarea exopolizaharidelor microbiene are câteva motivaţii, printre care: se produc în condiţii controlate, folosind microorganisme selecţionate şi substraturi ieftine; bioproduşii posedă o înaltă regularitate structurală; se poate obţine o gamă largă de polizaharide ionice şi neutre foarte specifice, cu o mare varietate de compoziţii şi proprietăţi; varietatea polizaharidelor microbiene nu se regăseşte printre polizaharidele vegetale şi nu pot fi reproduse prin sinteză chimică. Investigaţii aprofundate s-au făcut mai ales asupra polimerilor exocelulari bacterieni.

Polizaharidele extracelulare sunt considerate metaboliţi secundari ai celulei bacteriene, sintetizaţi atunci când o sursă de carbon este prezentă din abundenţă. Deşi nu au rol vital pentru celulă, pot avea unele funcţii, servind ca o barieră fizică între mediu şi celula microbiană. Materialul vâscos-gelatinos de la suprafaţa celulelor bacteriene încadrat în denumirea acceptată de glicocalix, cuprinde două tipuri de structuri diferenţiate prin compoziţie, extindere, comportament, semnificaţie biologică şi anume: capsulă şi stratul mucos (mucilagiu solubil). Se consideră că multe exopolizaharide sunt sintetizate printr-un mecanism identic sau similar celui implicat în sinteza peretelui celular, deşi unele sunt sintetizate exocelular. Sursele de carbon utilizate pentru sinteza lor sunt variate: glucide, hidrocarburi, substraturi petro-chimice, alcooli polihidrici inferiori, metan. Polizaharidele extracelulare pot fi neutre sau anionice, iar pe baza structurii chimice se împart în 2 grupe distincte: homopolizaharide şi heteropolizaharide. Unele sunt complexate cu variate grupări funcţionale ataşate la zaharuri. Structura fizică este multifibrilară, la majoritatea exopolizaharidelor bacteriene dublu helicală.

Polizaharidele extracelulare sau gomele microbiene sunt polimeri solubili în apă (hidrocoloizi), cu largi utilizări ca agenţi de îngroşare, gelificare, suspendare, emulsionare, floculare sau coloide protectoare. Comportarea în soluţie a acestor bioproduşi poate fi: newtoniană, pseudoplastică sau plastică. Datorită proprietăţilor manifestate, unele exopolizaharide microbiene pot înlocui cu succes polimerii de sinteză chimică în aplicaţii practice din diverse domenii (ind. alimentară, ind. textilă, chimică, farmaceutică şi cosmetică, medicină, biochimia analitică şi preparativă, epurarea apelor reziduale, ind. extractivă de ţiţei, foraje hidrogeologice, agricultură). O serie de exopolizaharide microbiene sunt deja obţinute ca produse comerciale, sub diferite denumiri: xanthan, alginat, zanflo, indican, dextran, curdlan, rhizan, pululan, scleroglucan (polytran).

Prezentarea este structurată pe următoarele aspecte: structurile exopolizaharidice din componenţa glicocalixului – capsula şi stratul mucos, evidenţierea aceptor structuri la bacterii; structura chimică şi fizică (structura primară şi secundară) a exopolizaharidelor bacteriene; sinteza exopolizaharidelor; proprietăţile exopolizaharidelor; semnificaţia biologică a exopolizaharidelor bacteriene; aplicaţii practice ale exopolizaharidelor microbiene în diferite domenii.

Top

APORTUL MICROORGANISMELOR ÎN PROCESE DE REMEDIERE

Mugur Ştefănescu, Doina Cîrstea

Institutul de Biologie Bucureşti, e-mail: mugur.stefanescu@ibiol.ro

Abordarea câtorva aspecte legate de bioremedierea zonelor afectate de prezenţa unor contaminanţi biodegradabili, se circumscrie în problematica actuală de protejare a mediului înconjurător.

Bioremedierea constituie un proces complex de tratare a unei zone contaminate, prin utilizarea microorganismelor capabile să metabolizeze anumite substanţe nocive, cu complexitate structurală, reducându-le la compuşi mai simpli, biodegrabili, cu un grad scăzut de toxicitate. Studiul unor tulpini bacteriene capabile să sintetizeze metaboliţi de tipul enzimelor şi a unor substanţe tensioactive de tipul biosurfactanţilor, ce intervin în formarea nanoemulsiilor, contribuind la procesul de metabolizare a hidrocarburilor sau hidraţilor de carbon, constituie o altă direcţie de abordare a problematicii.

Primele investigaţii au în vedere identificarea sursei de poluare din mediu, caracterizarea poluanţilor şi gradul de contaminare. Prezenţa contaminanţilor determină instalarea unor condiţii extreme şi ostile care influenţează microbiota zonală, ca urmare a modificărilor caracteristicilor fizico-chimice ale arealului afectat. În continuare este analizată microbiologic prezenţa grupelor fiziologice de bacterii cu potenţial biotehnologic (în special bacterii hidrocarbon-oxidante), care ulterior sunt testate în ceea ce priveşte sinteza de surfactanţi şi capacitatea biodegradativă, faţă de hidrocarburile contaminante.

Complexitatea biologică este astfel abordată: pornind de la aspecte macro, reprezentate de mediile extreme şi ostile, în toată complexitatea lor, focusând cercetarea prin analize microbiologice de caracterizare, identificare şi testare a unor tulpini bacteriene cu capacităţi degradative faţă de contaminaţii din mediu şi în final abordarea unor aspecte nano, prin aplicaţii ale unor tehnici moleculare de identificare bacteriană pe baza genei 16S, prin extracţie, amplificare şi secvenţiere a ADN genomic (tehnica RAPD) şi de caracterizare a unor produşi de metabolism, privind natura biochimică a moleculelor de surfactanţi bacterieni.

Lucrarea de sinteza astfel concepută poate fi considerată un vademecum al tehnologiilor bacteriene de remediere a mediului contaminat, în special cu hidrocarburi petroliere, având drept argument activitatea de cercetare a colectivului de bioremediere din cadrul Centrului de Microbiologie al Institutului de Biologie Bucureşti.

Top

CARBAMOIL FOSFAT SINTETAZA IN MICROORGANISME HIPERTERMOFILE: FILOGENIE SI TERMOADAPTARE

Cristina Purcarea

Institutul de Biologie Bucuresti, e-mail: cristina.purcarea@ibiol.ro

Sinteza carbamoil fosfatului, precursorul comun al căilor de biosinteză a argininei şi nucleotidelor pirimidinice, este catalizată de carbamoil fosfat sintetaza (CPS), o enzimă complexă atât din punct de vedere structural cât şi al mecanismului de reacţie şi al sistemelor de reglare allosterică şi metabolică. Identificarea şi caracterizarea CPS provenind din organisme care trăiesc la temperaturi în jur de 100°C au pus în evidenţă noi forme corespunzătoare etapelor intermediare ale evoluţiei filogenetice a acestei enzime, precum şi un ansamblu de mecanisme moleculare de adaptare la temperaturi înalte la nivel structural şi funcţional.

Structural, CPS este un heterodimer alcătuit din subunităţile glutamin amidotransteraza / glutaminaza (GLN) şi sintetaza (SYN), aceasta din urmă conţinând două domenii omoloage rezultate în urma unor procese de duplicare şi fuziune. In organismele eucariote, cele doua subunităţi ale CPS sunt fuzionate, mamiferele conţinând o proteină multifuncţională rezultată în urma fuziunii acestei CPS cu aspartat transcarbamoilaza (ATC) şi dihidroorotaza. Explorarea nişelor extremofile a evidenţiat în genomul archaeelor şi eubacteriilor hipertermofile prezenţa unor forme de tip ancestral la nivelul enzimelor implicate în sinteza carbamoil fosfatului. Astfel, CPS din Methanococcus jannaschii şi Aquifex aeolicus constituie heterotrimeri care conţin subunităţi distincte SYN1 şi SYN2 corespunzătoare celor două domenii ale subunităţii SYN, codate de gene separate şi nestructurate într-un operon. In procesul evolutiv, acest tip de enzimă reprezintă o etapă anterioară procesului de fuziune care a generat subunitatea SYN de tip bacterian. In unele organisme în care CPS este absentă, reacţia de sinteză a carbamoil fosfatului este catalizată de o enzimă catabolică, carbamat kinaza (CK), ale cărei structură şi mecanism de reacţie sunt diferite de cele ale CPS. Surprinzător, un nou tip de enzimă intermediar celor doi catalizatori ai carbamoil fosfatului, având o structură de tip CK şi un mecanism de reacţie de tip CPS, a fost pus în evidenţă în archaeonul hipertermofil Pyrococcus abyssi.

Temperaturile ridicate ale habitatelor microorganismelor hipertermofile au determinat o serie de adaptări moleculare atât la nivel structural şi funcţional al enzimei, cât şi la nivelul căii metabolice pentru protecţia metaboliţilor termolabili. Studiul unor CPS din organisme (hiper)termofile relevă stabilitatea intrinsecă remarcabilă la temperaturi ridicate a acestor enzime. Aceasta poate fi corelată la nivelul compoziţiei în aminoacizi cu prezenţa unor interacţii ionice şi hidrofobe suplimentare faţă de omologii mezofili la nivelul situsului activ şi al interfeţei dintre subunităţi. Pe de altă parte, stabilitatea acestor CPS este parţial extrinsecă, datorată asocierii dintre subunităţi enzimatice şi/sau dintre enzime (CPS-ATC). Procesul catalitic prezintă de asemenea adaptări pentru desfaşuararea etapelor la temperaturi înalte. Parametrii cinetici indică o afinitate aparentă ridicată pentru substratele termolabile, ATP şi glutamina. Reglarea allosterică a activităţii acestei enzime este la rândul ei influenţată de temperatură, în funcţie de termostabilitatea derivaţilor nucleotidici cu efect inhibitor. In plus, prezenţa unei reglări metabolice prin fosforilare/defosforilare la nivelul CPS din A. aeolicus marchează identificarea uneia dintre cele mai primitive căi de semnalizare identificate, având rol de atenuare a efectului inhibitor şi activator al UTP şi, respectiv, ornitinei.

In cazul acestui sistem enzimatic, termoadaptarea vizează de asemenea protecţia termică a produşilor intermediari termolabili prin tranferul direct (channeling) al carbamoil fosfatului între enzimele care iniţiază cele două căi metabolice implicate, ale argininei şi nucleotidelor pirimidinice. Astfel, în cazul microorganismelor hipertermofile a fost pus în evidenţă transferul direct parţial al carbamoil fosfatului între enzimele de cuplaj CPS-ATC şi CPS-ornitin transcarbamoilaza (OTC) care are loc în urma asocierii enzimatice tranzitorii. Acest proces împiedică contactul metabolitului termolabil cu mediul celular a cărui temperatura în jur de 100°C ar provoca degradarea sa rapidă, contribuind astfel la sinteza eficientă a argininei şi a pirimidinelor la temperaturi ridicate şi impiedicând formarea de cianat, produs toxic pentru celulă.

Strategiile structurale şi funcţionale ale acestui sistem enzimatic pentru funcţionare optimă în condiţii extreme de temperatură şi în cadrul organismelor cu material genetic redus oferă elemente cheie în descifrarea mecanismului de reacţie, a rolului unităţilor structurale (aminoacid, domeniu, subunitate, enzimă) în sinteza precursorului argininei şi pirimidinelor, precum şi a evoluţiei filogenetice a acestei clase de enzime şi a căilor metabolice implicate.

Top

DIVERSITATEA STĂRILOR FIZIOLOGICE ALE PROCARIOTELOR MARINE : COMPLEXITATEA UNOR STRUCTURI ŞI PROCESE LA NIVEL NANO (10^-9), MICRO (10^-6) ŞI MEGA (10⁶)

Ioan I. Ardelean

Institutul de Biologie Bucureşti, ioan.ardelean@ibiol.ro

Scopul acestei prelegeri este de a vă prezenta câteva aspecte esenţiale ale microbiotei marine cu accent pe două direcţii de cercetare de mare actualitate în microbiologia marină/oceanografia microbiologică:

A) Diversitatea stărilor fiziologice ale procariotelor în mediul marin

B) Ordinele de mărime foarte mari în timp şi spaţiu (de la 10^-9 la 10⁶sau mai mult) ale unor structuri şi procese microbiene (la nivel individual, populaţional şi de biom) esenţiale pentru trecutul, prezentul şi viitorul circuitelor biogeochimice în mediul marin, pentru viitorul sănătos al planetei noastre.

A) În ultimii ani s-a ajuns la concluzia, aproape unanim acceptată, conform căreia procariotele nesporulate se pot găsi în mediile naturale, inclusiv în mediul marin, într-una din următoarele cinci situaţii posibile, definite pe baze logice şi metodologice:

1. Celule viabile şi capabile de creştere şi multiplicare; fiecare dintre aceste celule este capabilă să formeze o colonie pe medii adecvate. Aceste celule sunt singurele care pot fi puse în evidenţă şi cuantificate prin metodele dependente de creştere şi multiplicare.

2. Celule rănite (injured). Aceste celule nu pot fi puse în evidenţă şi cuantificate prin metodele dependente de creştere şi multiplicare deoarece nu sunt capabile să formeze colonii pe medii adecvate deşi celulele sunt intacte morfologic şi active metabolic .

3. Celule care hibernează (dormand) au morfologie celulară intactă dar, spre deosebire de celulele rănite, nu sunt active metabolic (sau au un metabolism extrem de scăzut). În această stare celule nu pot fi cuantificate prin metode bazate pe creştere şi multiplicare.

4. Celule active dar necultivabile. Sunt celulele active metabolic dar care sunt incapabile de creştere şi multiplicare celulară pe mediile şi în condiţiile cunoscute la ora actuală. Prin dezvoltarea tehnicilor şi mediilor de cultivare, procariote iniţial necultivabile au putut fi cultivate în laborator .

5. Celulele moarte, care nu mai sunt intacte din punct de vedere morfologic, nu au niciun fel de activitate metabolică şi evident nu cresc şi nu se multiplică. Aceste celulele moarte la care conţinutul citoplasmei, inclusiv materialul genetic, se găseşte încă în interiorul celulei bacteriene pot fi evidenţiate prin colorare cu acridin orange sau alte substanţe care evidenţiază materialul genetic.

Celulele care la un moment dat sunt ranite sau hiberneaza pot redeveni cultivabile prin:

i) Recreştere;

ii) Iniţierea cu succes a unor procese de reparaţie genetică;

iii) “Trezirea” celulelor care s-au aflat în stare de latenţă sau hibernare ;

iv) prin resuscitare (resuscitation) care constă în redobândirea capacităţii de a forma colonii (prin creştere şi multiplicare celulară) pe un anumit mediu. De exemplu în cazul lui Micrococcus luteus resuscitarea celulelor incapabile de diviziune are loc în prezenţa celulelor din aceeaşi specie, viabile şi capabile de diviziune, care sintetizează şi eliberează în mediul extracelular feromoni care induc fenomenul de resuscitare.

În corelaţie cu unele dintre aceste stări şi ale tranziţiilor dintre ele, unele dintre componentele ultrastructurale ale diferitelor tipuri de procariote marine, suferă modificări fie ale dimensiunilor fie ale numărului de exemplare care se găsesc într-o singură celulă.

Astfel, capsula bacteriană, în condiţii oligotrofe, îşi modifică dimensiunile putând urma două direcţii diferite:

a) în cazul celulelor care ramân individuale, odată cu deteriorarea condiţiilor trofice, capsula nu mai este reînnoită, ceea ce face ca, bacteriile care în condiţii naturale normale sunt capsulate, în condiţii de înfometare prelungită (sau de îmbătrânire celulară) sa nu mai prezinte capsulă. Această caracteristică ultrastructrurală este fundamentul unei metode ingenioase care diferenţiază bacteriile marine viabile (care au capsulă) de cele neviabile (care nu au capsulă), majoritatea bacteriilor marine fiind capsulate.

b) În cazul celulelor care pot forma agregate, capsula-glicocalixul, creşte în dimensiuni consolidând mecanic mai multe celule bacteriene cu formare la interfaţa solid/lichid de biofilme bacteriene. De remarcat formarea unor asemenea ansambluri bacteriene şi în cuprinsul masei de apă, unde bacteriile nu mai au în aceste condiţii o distribuţie uniformă la nivel microscopic. Aceste ansambluri planctonice de bacterii, nu mai pot fi consumate de către flagelatele heterotrofe tocmai datorită dimensiunilor mari, cea ce le conferă un avantaj în viaţa reală în mediul marin . Atenţie, dacă dimensiunile cresc în continuare, aceste ansambluri bacteriene pot fi consumate de către alte organisme bacteriovore, specializate pe ingestia unor particule alimentare de aceste dimensiuni (şi care în mod normal nu se hrănesc cu celule bacteriene individuale).

Alte componente precum ribosomii, în condiţii de înfometare nu-şi modifică dimensiunile (dimensiunile subunităţii mari şi ale celor mici sunt invariabile) dar numărul lor scade foarte dramatic, astfel că şi numărul de molecule de ARNmesager scade, corespunzător ratei limitate a biosintezei ribosomale a proteinelor în aceste condiţii.

Dimensiunile celulei bacteriene pot varia în cadrul indivizilor aceleiaşi specii/populaţii în funcţie de concentraţiile diferiţilor nutrienţi prezenţi în acel mediu la un moment dat. În condiţii de înfometare, sunt specii bacteriene care sunt în continuare capabile de diviziune (la intervale mari de timp) deşi celula nu mai creşte în dimensiuni; în consecinţă, în urma diviziunii ,cele două celule fiice sunt practic la jumătatea volumului celulei mamă, formându-se astfel celule bacteriene de dimensiuni foarte mici. Aceste celule miniaturizate sunt considerate a fi în stare de latenţă. Procesul de miniaturizare reflectă diversitatea dimensiunilor uneia şi aceleiaşi specii bacteriene, conferind o modalitate de supravieţuire şi propagare în condiţiile ostile ale unor medii naturale; de exemplu, miniaturizarea este o modalitate prin care procariotele evită microorganismele bacteriovore, cum ar fi flagelatele heterotrofe.

Exista în mediul marin procariote care, în mod normal, când metabolismul lo reste foarte intens au celula de dimensiuni foarte mici comparativ cu dimensiunile tipice ale unei celule procariote (de ordinul micronilor). Astfel, cianobacteria Procholorococcus la care celula este de dimensiuni foarte mici (în jur de 0,6µm=600nm) este la ora actuală cel mai mic organism fotosintetic capabil de fotosinteză oxigenică şi totodată cel care însumează cel mai mare număr de indivizi biologici.În consecinţă, dimensiunile foarte mici ale unor procariote marine nu indică în mod automat o stare de latenţă, existând şi excepţii, precum Procholorococcus sau alfa-proteobacteria Pelagibacter ubique (SAR11) care sunt foarte active metabolic şi sunt reprezentate de populaţii printre cele mai numeroase în mediul marin, cu impact semnificativ cantitativ în circuitul biogeochimic al elementelor chimice pe planeta noastră.

B) Scala de timp la care au loc diferite procese metabolice şi impactul geologic al acestor procese metabolice, este foarte mare. De exemplu, procesele fotochimice în fotosinteză sunt de ordinul microsecundelor iar circuitul carbonului întreţinut de către procesul de fotosinteză prin ramura sa de pompare biologică a carbonului în adâncul oceanului are loc la nivel de sute de ani! Scala de spaţiu la care au loc diferite procese metabolice şi impactul geologic al acestor procese metabolice este deasemenea foarte mare. Aminteam de cianobacteria Procholorococcus cel mai mic organism fotosintetizant oxigenic care, datorită populaţiilor uriaşe pe care le realizează pe suprafeţe foarte întinse, poate fi detectat optic la nivel populaţional din spaţiul cosmic, spre deosebire de o balena care nu poate fi vizualizată în acest mod!

Top

COMPLEXITATEA STRUCTURALĂ A PERETELUI CELULAR LA FUNGI

Ioana Gomoiu, Daniela Mogîldea

Institutul de Biologie Bucureşti, ioana.gomoiu@ibiol.ro

Celula fungică este în prezent un model de studiu pentru structura şi funcţiile peretelui celular (PC) la organismele eucariote. Peretele celular este esenţial pentru creşterea şi supravieţuirea fungilor, menţinerea viabilităţii sporilor, în mediile specifice pentru diferitele categorii taxonomice.

Componenta majoră a PC este reprezentată de 1,3-β-glucan dar în funcţie de specie se poate adăuga 1,3-α-glucan sau 1,6-β-glucan.

Chitina este un homopolimer format din resturi de N-acetilglucosamină legate β-1,4 şi se găseşte în cantităţi mici la levuri (1-2% din greutatea uscată) sau mari la fungii filamentoşi (10-3-% din greutatea uscată). Aceste componente formeză o reţea microfibrilară care conferă celulei rigiditate.

În reţeaua de microfibrile sunt integrate şi manoproteinele care participă la menţinerea integrităţii PC. La levuri, manoproteinele legate non-covalent, covalent, GPI (glicosil fosfatidil inositol) ancorate în PC sunt esenţiale pentru supravieţuire în diferite condiţii de mediu. La Candida albicans, s-au pus în evidenţă două gene alele cu rol în asamblarea PC. În cazul deleţiei genei ROT1 are loc modificarea morfologiei celulei, reducerea conţinutului de glucan, creşterea celui de chitină şi imposibilitatea legării manoproteinelor GPI în peretele celular.

Legarea β glucanului şi a chitinei de către calcofluor a avut drept consecinţă cristalizarea microfibrilelor, reducerea ratei de creştere, liza la nivelul vârfurilor hifale şi reducerea ritmului de încorporare a manoproteinelor.

Creşterea fungilor este unipolară. Peretele existent în vârful hifal are rolul de matriţă în care se integrează “materialul nou” în punctele de creştere. În vârfurile hifale, presiunea hidrostatică internă (turgor) are în mod normal numai câteva atmosfere iar forţa sa este egală în toate direcţiile. Turgor se poate modifica dar efectul direct asupra creşterii nu este întotdeauna exprimat. În consecinţă, rolul major revine atât reglării locale la nivelul PC cât şi proprietăţilor citoscheletonului. Peretele vârfului hifal trebuie să îşi exercite funcţiile de elasticitate şi extensibilitate şi să integreze noile componente cu rol structural. Ruperea este prevenită prin prezenţa microfibrilelor de actină susţinute de glicoproteinele (conţinând treonină şi serină transmembranare). În celulele poziţionate sub vârful hifal, PC este considerat a fi matur şi inextensibil, cu legături încrucişate şi stabile între componente. În perioada de maturare, microfibrilele de chitină se leagă chimic stabil în matricea structurală. La Aspergillus nidulans, zona majoră de creştere apicală este dispunsă pe lungimea de 3μm. La rata de creştere 0,2-0,5 μm min^-1 maturarea PC este completă când celula apicală are lungimea de 6μm.

Ramificarea echivalează cu formarea unui nou vârf hifal dintr-un PC matur care a devenit extensibil prin acţiunea enzimelor (ex.endoglucanaze). La Aspergillus nidulans, vâscoelasticitatea a fost pusă în evidenţă prin cercetările de microscopie cu forţă atomică atât în vârfurile hifale cât şi în vârfurile ramificaţiilor (celule active din punct de vedere al creşterii biologice şi al colonizării substratului).

Septul transversal este structura care apare la sfârşitul mitozei şi separă noua ramificaţie de celula generatoare. Sinteza chitinei este esenţială pentru formarea septului. La levuri s-a identificat gena Bni4p cu rol în asamblarea chitinei, arhitectura şi integritatea septului. Deleţia genei Bni4p determină modificarea distribuţiei chitinei atât în PC cât şi în septul transversal. În absenţa sintezei chitinei, levurile formează “muguri” dar dispunerea celulelor este liniară ca urmare a faptului că citoplasma celulelor nu este complet separată.

În prezenţa unor factori fizici şi chimici, integritatea celulei poate fi profund afectată. La fungi s-a pus în evidenţă faptul că, homeostazia PC este programată iar celula îşi modifică metabolismul (datorită versatilităţii acestuia) pentru a rezista condiţiilor nefavorabile. Astfel, Saccharomyces cerevisiae, deţine gena (WSc1p) pentru sinteza unei proteine care acţionează ca senzor pentru formarea unor legături chimice care sporesc integritatea PC.

Condiţiile de stres care tind să afecteze integritatea structurală a peretelui hifal determină răspunsul numit mecanism compensatoriu (Brmejo şi colab., 2008). Acesta contribuie la salvarea celulei prin: creşterea conţinutului de β glucan şi chitină, modificări ale arhitecturii peretelui celular (alte tipuri de legături chimice, creşterea conţinutului unor proteine, relocalizarea unor proteine cu rol structural).

Proprietăţi ca aderarea şi recunoaşterea substratului sunt dependente de existenţa unor proteine. Astfel, Candida albicans, deţine gena (Ecm33p) care codifică informaţia genetică pentru sinteza proteinei GPI care se leagă de alte două proteine din PC şi în această configuraţie asigură integritatea şi virulenţa.

Caracteristica de bază a suprafeţei celulei este adaptarea. Peretele celular tinde să îşi menţină funcţia de bază la fel ca şi organitele, dar trebuie să evolueze mai rapid datorită expunerii directe şi permanente la forţele selective biotice şi abiotice.

O modalitate de a testa relaţia cauzală dintre evoluţia peretelui celular şi celula ca întreg este de a studia conservarea componenţilor macromoleculari ai acestuia. Cavalier-Smith (2004) consideră că peretele celular fungic rezultă din pereţii care conţin chitină ai chiştilor ancestrali ai protistelor, caracterizaţi printr-o mare rezistenţă la uscăciune. În prezent, pereţi celulari cu un conţinut ridicat în chitină s-au pus în evidenţă la Entamoeba, Phytophtora şi Giardia.

Unii fungi conţin în PC proteine comune şi altor eucariote. Dintre acestea menţionăm glicosilazele, proteazele, proteinele necesare pentru sinteza GPI, proteine Pri, chaperone, ceea ce dovedeşte originea lor ancestrală. Se consideră că genele corespunzătoare reprezintă expresia genetică conservată a unor activităţi metabolice implicate în formarea peretelui celular.

Unele proteine conservate ale fungilor au homologi şi în lumea plantelor: glucosidaze (Dse4, Spr1, Exg1), manosidaze care participă la biogeneza glicoproteinelor (Mns1, Mnl1) şi a subunităţilor Fks β-1,3-glucan sintetaza.

Enzimele cu rol în sinteza chitinei sunt de asemenea bine conservate. Astfel, două enzime (chitin diacetilaze) implicate în calea de biosinteza N-acetilglucosaminei (Gfa1 şi YMR84w) sunt conservate la ascomicete şi bazidiomicete. Homologia enzimelor şi a procesului de sinteză a chitinei la fungi, metazoare, amoebozoare şi chromalveolate susţine originea ancestrală şi continuitatea rolului pereţilor celulari ai eucariotelor.

Top

STRUCTURI CRISTALINE DE SUPRAFAŢĂ (STRATUL S), COMPONENTE ALE ÎNVELIŞULUI CELULAR LA PROCARIOTE (BACTERIA ŞI ARCHAEA), CU IMPACT ÎN NANOBIOTEHNOLOGII

Gabriela Popescu, Lucia Dumitru

Institutul de Biologie Bucureşti, gabriela.popescu_teodosiu@ibiol.ro

Diferitele structuri ale învelişului celular de la organismele procariote (Archaea şi Bacteria), în special straturile externe expuse mediului extracelular, reflectă adaptările specifice ale acestor microorganisme la un spectru larg de factori de selecţie, dobândite în cursul evoluţiei (Sleytr şi Beveridge, 1999; Sleytr et al., 1993).

Termenul “S-layer” (strat S) este utilizat pentru descrierea reţelelor cristaline bidimensionale ale subunităţilor proteice, care formează straturile de suprafaţă ale celulei procariote (Sleytr şi colab.,1988).

Straturile cristaline ale învelişului celular (S-layers) au fost identificate la diferite microorganisme aparţinând tuturor grupelor filogenetice majore ale domeniului Bacteria şi de asemenea, reprezintă o trăsătură esenţială la Archaea (Murray, 1993).

În prezent, stratul S este recunoscut ca unul dintre componentele comune ale învelişului celular la organismele procariote, fiind alcătuit dintr-un singur tip de proteină sau glicoproteină, cu capacitatea de a se asambla într-o reţea monomoleculară (Messner şi Sleytr, 1992; Sleytr şi colab. 1996).

La majoritatea microorganismelor din domeniul Archaea, stratul S reprezintă componenta unică a învelişului celular lipsit de peptidoglican şi apare frecvent integrat în bistratul lipidic membranar (Sleytr, 1997; Sara şi Sleytr, 2000; Eichler, 2003). La bacteriile Gram-pozitive şi la Archaea Gram-pozitive, reţeaua stratului S este ataşată de o matrice rigidă, compusă din peptidoglican şi respectiv, pseudomureină. În cazul bacteriilor Gram-negative, stratul S este legat de lipopolizaharidele componente ale membranei externe.

În cursul dezvoltarii celulei bacteriene, asamblarea reţelelor cristaline proteice de suprafaţă reprezintă un proces continuu, care se realizeaza în acelaşi timp cu cresterea celulară (Sleytr et al., 1999).

Din punct de vedere structural, straturile S au o grosime de 5 - 25 nm şi sunt alcătuite din unităţi identice dispuse sub formă de reţea, care determină formarea unor pori identici ca morfologie şi mărime. În general, mărimea porilor este de 2-8 nm (chiar 10 nm) şi aceştia pot ocupa până la 70 % din suprafaţă. Aceste caracteristici justifică încadrarea acestor structuri în domeniul nanobiomaterialelor.

Pe baza simetriei determinată de modul de aranjare a subunităţilor, straturile S pot fi clasificate în straturi S cu simetrie oblică, pătrată, hexagonală (predominantă la Archaea). În funcţie de numărul subunităţilor componente ale unei unităţi componente de bază, se disting straturi S cu simetrie de tip p1, p2, p3, p4 şi p6, în care unităţile morfologice sunt alcătuite din una, două, trei, patru şi respectiv, şase subunităţi identice (Pum şi Sleytr, 1995).

Analizele chimice ale straturilor S de la unele cianobacterii şi microorganisme archaeane au arătat că acestea sunt compuse dintr-un singur tip de proteină sau glicoproteină cu greutate moleculară cuprinsă între 40 - 170 (200) KDa (Sleytr et al., 1993).

Straturile S conţin cantităţi crescute de glucoză, acid glutamic, acid aspartic şi lizină. În structura straturilor S, predomină aminoacizii hidrofobi (aproximativ 40-60 mol %) iar conţinutul în arginină, histidină, metionină este scăzut. Aminoacizii care conţin sulf (cisteina) lipsesc sau se găsesc în cantităţi reduse. Proteinele straturilor S de la numeroase microorganisme archaeane pot prezenta lanţuri carbohidrate legate covalent, compuse din 20-50 unităţi conţinând hexoze neutre, pentoze, heptoze, 6-deoxihexoze, aminozaharuri.

Aceste straturi superficiale conferă microorganismelor o serie de avantaje deoarece îndeplinesc anumite funcţii importante pentru celule: au rol de înveliş protector, de sită moleculară cu rol important în ultrafiltrare, de canal ionic şi sunt structuri implicate în interacţiile suprafeţei celulare şi în determinarea formei celulare (la Archaea) (Sara şi Sleytr, 2000).

Subunităţile straturilor S izolate de la o varietate de microorganisme, au capacitatea de a se reasambla în suspensie, pe filme lipidice, pe liposomi sau pe suporturi solide (polimeri ca de exemplu, polistiren; metale; plăci de siliciu; celuloză; grafit; mică) într-o reţea monomoleculară identică cu cea observată în celulele intacte (Sleytr, 1975; Sleytr şi Messner, 1989, Beveridge şi Graham, 1991).

Capacitatea proteinelor straturilor S de a recristaliza în monostrat este o trăsătură cheie pentru o gamă largă de aplicaţii în biotehnologie, nanotehnologie şi biomimetică, ca de exemplu: obţinerea de membrane de ultrafiltrare, imobilizarea unor molecule funcţionale (enzime, anticorpi, liganzi), obţinerea de dispozitive bazate pe straturi S (care pot fi utile în diagnosticul diferitelor tipuri de alergii), construcţia de biosenzori (dispozitive care detectează sau măsoară prezenţa anumitor molecule: ADN, antigene, etc), obţinerea de vaccinuri conjugate şi de matrice pentru biomineralizare controlată Pum şi Sleytr, 1999).

Studii realizate la nivel international privind structura, chimia, genetica, asamblarea şi funcţiile straturilor S, au evidenţiat potentialul considerabil al utilizării acestora pentru constituirea de reţele regulate în biotehnologie, biomimetică, biomedicină şi nanotehnologii moleculare.

În cadrul Centrului de Microbiologie al Institutului de Biologie au fost realizate cercetări care au avut ca scop izolarea straturilor S de la unele tulpini de microorganisme archaeane extrem halofile, caracterizarea biochimică (gradul de hidrofobicitate, sarcina de suprafaţă, dezintegrarea în subunităţi proteice şi caracterizarea electroforetică a acestora), evidenţierea directă a reţelei cristaline proteice prin observaţii de microscopie electronicã şi testarea adeziunii proteinelor stratului S la suporturi nanostructurate pe bază de siliciu. Rezultatele obţinute prin metodele indirecte de evidenţiere utilizate (caracterizarea biochimică) au demonstrat prezenţa stratului S la tulpinile haloarchaeane testate şi au indicat izolarea acestuia. Studiile de microscopie electronică au permis evidenţierea directă a reţelei cristaline proteice din structura stratului S şi au confirmat izolarea acestuia de la tulpinile haloarchaeene, precum şi ataşarea proteinelor stratului S la plăcuţele de siliciu testate.

Top

ASPECTE ALE COMPLEXITĂŢII BIOLOGICE DIN LACURILE SĂRATE

Mădălin Enache

Institutul de Biologie Bucureşti, madalin.enache@ibiol.ro

Interesul relativ redus acordat studiului apelor sărate este argumentat prin faptul că acestea, au fost privite până de curând, ca ecosisteme ce se abat de la tipul normal, fiind considerate medii sterile şi lipsite de forme de viaţă, cu importanţă economică redusă şi cu potenţial ştiinţific scăzut. Studii recente, au dovedit contrariul şi au arătat că lacurile sărate pot avea potenţial economic, comercial, ştiinţific şi se caracterizează printr-o biodiversitate bogată, de cele mai multe ori endemică.

În prezent, pot fi identificate două tipuri principale de ape sărate: apa mărilor şi oceanelor şi lacurile sărate continentale fără legătură directă cu mediul marin. Acestea din urmă sunt cunoscute şi ca ape atalazohaline sau epicontinentale. Salinitatea apelor continentale este reprezentată de concentraţia totală a sărurilor dizolvate. Apele cu conţinut relativ ridicat de sare sunt usor de identificat, în principal după gustul sărat care nu caracterizează şi apele cu conţinut mai scăzut de sare. O serie de observaţii biologice şi de natură fizico-chimică susţin că sub o valoare a salinităţii de 3 g/L apele pot fi considerate ape dulci, iar peste această valoare pot fi considerate ape sărate. Din punct de vedere chimic, salinitatea este principala caracteristică a lacurilor sărate cu influenţe importante pentru alte trăsături fizico-chimice şi biologice.

În termeni biologici, lacurile sărate sunt privite în mod curent ca habitate cu biodiversitate redusă, diferite de alte tipuri de lacuri. În acest context, trebuie precizat că biota adaptată lacurilor sărate nu poate fi considerată extremă în aceste lacuri, în acest caz condiţiile din afara lacului fiind extreme pentru biota “extremă”. Pe de altă parte, chiar dacă biodiversitatea din lacurile sărate este mai redusă decât cea prezentă în mod firesc în lacurile dulci, o varietate largă şi un număr mare de specii se regăsesc în lacurile sărate, în special cele cu o salinitate moderată. Similar lacurilor dulci sau altor ecosisteme şi în lacurile sărate se desfăşoară procesele ecologice care caracterizează un ecosistem (producţie, descompunere, ciclul nutrienţilor, etc.).

Aproape toate grupele caracteristice descoperite în apele dulci pot fi identificate şi în apele sarate. Desigur, speciile, genurile şi uneori familiile nu sunt aceleaşi, dar, în ansamblu, biota lacurilor sărate nu este diferită în compoziţie de cea a apelor dulci.

Habitatele hipersaline oferă condiţii preferate de arheele halofile, alte organisme neavând capacitatea de a se adapta. Până în prezent 27 de genuri cu peste 100 de specii au fost publicate şi validate, dar xistă un număr considerabil de specii (secvenţe genice) publicate dar nevalidate. Acest aspect evidenţiază diversitatea bogată prezentă în medii hipersaline, privite până nu de mult ca incompatibile cu viaţa. Cunoscute generic ca şi halobacterii ele sunt organotrofe aerobe, unele specii utilizând bacteriorodopsina pentru a conduce anumite procese metabolice. Datorită pigmenţilor carotenoizi (în principal bacterioruberine) coferă apelor culoare în variate nuanţe de roşu – portocaliu. În lacurile sărate sunt întâlnite şi o serie de eubacterii. Cele mai importante sunt fototrofe (bacterii purpurii, cianobacterii) dar se regăsesc şi o serie de eubacterii cu alt tip de nutriţie. Ele utilizează forme diferite ale bacterioclorofilei ca pigment care să absoarbă energia luminoasă. Au fost identificate specii aparţinând genurilor Rhodospirillum, Chromatium, Ectothiorhodospira, Prostecochloris.

Asupra prezenţei bacteriilor în lacurile sărate se impune o menţiune cu privire la stromatoliţi. Aceştia sunt fosile sau structuri vii formate dintr-un ansamblu de bacterii şi sedimente. Cel mai adesea laminate, sunt printre cele mai cunoscute fosile ale organismelor (unele dintre ele cu vârsta de circa 3 miliarde ani) şi par a fi limitate la apele marine de coastă şi lacurile sărate. Structuri similare stromatoliţilor sunt cunoscute şi din diferite lacuri sărate de natură antropică (precum şi din localităţi de coastă). Elementele biologice ale celor mai vechi stromatoliţi sunt bacteriile purpurii şi verzi, cianobacterii.

Dintre alge, în lacurile hipersaline, Dunaliela salina este întâlnită frecvent, importanţa ei din punct de vedere economic fiind conferită de capacitatea de a produce carotenoizi. Speciile de Artemia sunt cele mai cunoscute crustacee adaptate la condiţiile de viaţă oferite de apele hipersaline.

Lacurile sărate pot fi asociate atât unor valori economice cât şi de altă natură. Ele pot constitui rezerve şi surse de minerale şi alţi produşi cu largă aplicabilitate industrială, pot fi surse de apă, de energie, pot constitui medii naturale în care să fie cultivate specii (bacterii, alge) care produc metaboliţi cu importanţă economică (proteine, pigmenţi). Aceste lacuri pot fi utilizate în scopuri terapeutice, pentru investigaţii ştiinţifice iar pentru comunităţile care s-au dezvoltat în jurul lor sunt asociate şi unor valori culturale şi educaţionale.

Top

MICROSPORIDIILE – UN „MICRO-UNIVERS” ÎN EXPLORARE CONTINUĂ

Doina Codreanu-Bălcescu

Institutul de Biologie Bucureşti, doina_cb@yahoo.co.uk

În clasificările actuale, Microsporidia Balbiani, 1882 reprezintă o subunitate de rangul II printre Opisthokonta, una din cele 6 super-grupe de Protiste (Adl et al., 2005). Sunt eucariote unicelulare, obligatoriu parazite intracelular şi cuprind peste 150 genuri şi 1200 specii, care infectează teoretic toate filumurile animale, de la protozoare (Apicomplexa, Ciliophora) la metazoare (Myxozoa, Coelenterata, Plathelminthes, Nematoda, Bryozoa, Annelida, Mollusca, Arthropoda, Vertebrata), cu cea mai mare distribuţie la artropode şi peşti osoşi (Hausman, Hülsmann, Radek, 2003; Larsson, 2005; Vossbrinck şi Degrunner-Vossbrinck, 2005).

Microsporidiile au generat un interes foarte mare şi din cauza genomului lor redus şi compact, iar studiile comparative moleculare şi filogenetice continuă să sprijine o relaţie între Microsporidii şi Fungi.

Microporidiile parazite la om

De când au fost descoperite ca producând o diaree persistentă şi o boală sistemică la pacienţii SIDA, interesul biomedical asupra acestor organisme a crescut extraordinar (Desportes et al., 1985). Recunoaşterea microsporidiilor ca o cauză a infecţiilor oportuniste la pacienţi SIDA a crescut mult aprecierea acestor organisme şi a abilităţii lor de a se adapta şi infecta un cerc larg de animale, inclusiv omul.

Au fost identificate până în prezent 14 specii (aparţinând la 8 genuri), ca agenţi infecţioşi la om; cele mai prevalente sunt Enterocytozoon bieneusi şi membrii familiei Encephalitozoonidae (Didier şi Weiss, 2008). Microsporidiile au fost recunoscute ca patogeni emergenţi şi oportunişti asociaţi cu un cerc larg de sindroame clinice la persoanele cu HIV/SIDA, călători, copii, primitori de transplante de organ, persoane mai vârsnice. Infecţiile sunt adesea trecute cu vederea, din cauza dimensiunii reduse a agentului infecţios. Albendazolul este eficient în tratarea infecţiilor cu Encephalitozoon spp., dar nu se cunosc medicamente eficiente pt. infecţiile cu E. bieneusi. Această din urmă specie este dificil de studiat, deoarece lipsesc culturile de ţesuturi şi modelele animale mici care să simuleze infecţiile umane.

Încă se dezbate dacă infecţiile cu microsporidii rămân persistente la indivizii asimptomatici imuno-competenţi, se reactivează în condiţii de imuno- compromitere, sau se transmit la alţi oameni în situaţii de risc, aşa cum sunt graviditatea sau donarea de organe.

Sunt necesare metode de diagnostic serologic de încredere, care să suplimenteze PCR sau histochimia, în cazurile când eliberarea sporilor poate fi sporadică. Metodele de diagnostic îmbunătăţite sunt necesare pentru a releva un larg cerc de infecţii şi ca să ajute în stabilirea profilurilor moleculare epidemilogice pentru definirea surselor şi modurilor de transmitere la om. Există interese despre potenţiala transmitere prin apă sau alimente.

Cunoaşterea completă a genomului de Encephalitozoon cuniculi (Katinka et al., 2001) şi studiile în curs asupra genomurilor la Anncaliia (syn. Brachiola, Nosema) algerae, Spraguea lophii, Antonospora (syn. Nosema) locustae şi E. bieneusi au permis adâncirea cercetărilor în genomica, proteomica şi biologia fundamentală a microsporidiilor (Keeling et al., 2005; Texier et al., 2005). 007) şi se aşteaptă ca analizele comparative genomice şi proteomice care se continuă să producă informaţii adiţionale despre filogenia şi taxonomia microsporidiilor (Tzipori, 2007).

De asemenea, studiile curente asupra genomicii şi proteomicii comparative a microsporidiilor vor putea produce noi lămuriri asupra biologiei microsporidiilor şi să promoveze dezvoltarea unei prevenţii eficiente şi strategii terapeutice.

Sporul microsporidian

Spre deosebire de sporii bacterieni, care sunt generaţi în răspunsul la condiţiile de stres din mediul înconjurător, sporii de microsporidii se dezvoltă ca un stadiu matur şi infecţios al ciclului biologic. Ca şi sporii bacterieni, sporii de microsporidii sunt rezistenţi şi supravieţuiesc perioade lungi de timp în mediul înconjurător. Sporii de microsporidii care infectează mamiferele sunt relativ mici (1-3 µm x 1,5-4 µm).

Peretele sporului este constituit dintr-un un strat extern glicoproteic (exospor) şi un strat intern chitinos (endospor) (Southern et al., 2007). La acest nivel s-au identificat mai multe proteine, incluzând Swp1, Swp2, Swp3 (En P2) şi EnP1 (Peuvel-Fanget et al., 2006; Xu et al., 2006); unele dintre acestea (ca de ex. EnP1) pot fi implicate în adeziunea peretelui sporal la celulele gazdă sau mucină, prin aceasta jucând un rol în procesul de invazie.

Citoplasma (sporoplasma) consistă din: un nucleu în aranjament monocariotic sau diplocariotic, un disc de ancorare anterior, un polaroplast membranos lamelar, care pare a include un aparat golgic atipic, vezicule polare care ar putea fi mitocondrii reduse, denumite mitosomi, reticulum endoplasmic, ribosomi şi o vacuolă posterioară (Vavra şi Larsson 1999; Burri et al., 2006; Beznoussenko et al., 2007).

Sporul microsporidian posedă un aparat invaziv compus dintr-o structură foarte specializată, unică în lumea eucariotică, tubul polar, reprezentând unul dintre cele mai sofisticate mecanisme de infecţie. Tubul polar apare ca emergent din discul de ancorare şi apoi se înfăşoară de numeroase ori în interiorul părţii posterioare a sporului. O schimbare în presiunea osmotică, având ca rezultat umflarea vacuolei posterioare, cauzează extruzia bruscă a tubului polar, urmată de transferul conţinutului citoplasmic, prin tubul polar lung de 50-500 µm, în iniţierea intrării parazitului în interiorul unei noi celule gazdă, în cursul germinării sporului. Mecanismele de germinare şi de formare a tubului polar rămân a fi determinate, ca şi mecanismul prin care sporoplasma pătrunde în celulele gazdă.

În componenţa tubului polar microsporidian au fost identificate 5 proteine, folosind abordări proteomice, şi s-a sugerat că, cel puţin pentru speciile de microsporidii studiate până astăzi, acestea definesc o familie nouă de proteine (Polonais et al., 2007).

La Encephalitozoon cuniculi au fost identificate 3 proteine tubulare, numite PTP1, PTP2 şi PTP3 şi s-au raportat, de asemenenea, şi gene aranjate în tandem codificând proteinele majore PTP1 şi PTP2 la alte 2 specii de Encephalitozoon, ca şi la Antonospora locustae şi Paranosema grylli parazite la insecte; în genomul de A. locustae s-au găsit mai multe gene care codifică proteine de tip PTP2. PTP1 şi PTP2 conţin reziduri de cisteină şi par să interacţioneze una cu alta, iar PTP1, care este cel mai abundent component al tubului polar, este modificată prin adăugarea de reziduri de manoză O-legată, care probabil că joacă un rol în adeziunea tubului polar la celulele gazdă (Xu et al., 2003; Peek et al., 2005). Recent s-au mai identificat 2 noi componente ale tubului polar (PTP4 şi PTP5) la E. cuniculi şi A. locustae. La ambele specii, genele care codifică aceste noi PTP-uri sunt, în mod similar, adunate pe un cromozom, şi nu prezintă homologii cu proteinele din baze de date. Ptp4 din A. locustae este de un interes special, deoarece pare a fi singura localizată la sfârşitul tubului polar extruzat, sugerând un rol potenţial in aderenţa la celula gazdă. S-au făcut unele experimente preliminarii pentru a caracteriza interacţiunile dintre PTP-uri în timpul formării şi funcţionării tubului polar.

Serurile de la pacienţii cunoscuţi ca fiind infectaţi cu microsporidii exprimă anticorpii care se leagă de tubul polar, sugerând că PTP-urile pot să servească ca antigeni.

Consideraţii filogenetice şi taxonomice

Clasificarea Microsporidiilor şi cunoaşterea speciilor din interiorul acestui filum au fost bazate istoric, iniţial pe morfologie (întâi microscopie optică, apoi la nivel ultrastructural), biologie şi caracteristici de habitat, iar mai recent s-au aplicat în taxonomia aceastora filogenii moleculare. Primele studii de filogenie moleculară, comparând secvenţe de AND-r, au sugerat că microsporidiile ar fi fost printre cele mai timpuriu sau adânc ramificate eucariote, din cauza lipsei unor mitocondrii tipice, aparat Golgi şi peroxizom, la care se adaugă prezenţa ribozomilor mici, de tipul celor de la procariote (Vossbrinck et al., 1987).

Totuşi, ulterior s-a găsit că microsporidiile prezintă multe gene cu evoluţie rapidă şi (ca artefact) un braţ lung de atracţie a unor astfel de gene care evoluează rapid şi asemenea fapte au pus sub semnul întrebării aceste interpretări timpurii.

Microsporidiile sunt în prezent interpretate ca fiind o ramură eucariotică înalt divergentă, bine adaptate şi paraziţi specializaţi, aparţinând, sau poate reprezentând un grup soră cu Fungi (Keeling şi Slamivits, 2004; Gill şi Fast 2006).

Într-o raportare recentă (James et al., 2006), au fost respinse 8 plasări teoretice în cadrul fungilor, în urma culegerii de date de la un număr mare de specii şi comparaţii cu mai multe gene, din care a rezultat ipoteza că microsporidiile ar trebui să fie situate fie la baza arborelui fungic, fie în interiorul Chytridiomycota sau în interiorul Entomophthorales.

Microsporidiile reprezintă modele importante de compactare extremă a genomului eucariotic şi de adaptare celulară şi par a fi foarte reduse şi simplificate în raport cu alte celule eucariotice.

Ele sunt particulare, deoarece conţin unele dintre cele mai mici genomuri de eucariote, datorită atât reducerii cât şi compactării genelor. De exemplu, genomul de Encephalitozoon cuniculi constă din 2,9 Mb pe 11 cromozomi cu aproximativ 2000 de gene strâns îndesate, care au câţiva introni, sunt mai scurte decât proteinele corespunzătoare de la alte eucariote şi au regiuni de codare care coincid parţial. Dimensiunile genomului la microsporidii sunt estimate curent între 2,3 Mb pe 11 cromozomi de Encephalitozoon intestinalis, până la 19,5 Mb pe 16 cromozomi de Glugea atherinae.

Microsporidiilor le lipsesc multe din genele care codifică proteine în căile metabolice şi regulatoare şi le reţin pe acelea în legătură cu transportul surselor de energie şi metaboliţi, probabil ca o consecinţă a dependenţei de celula gazdă.

În plus, la sporoblastul şi stadiile sporului au fost găsite exprimări ale proteinelor care sunt protectoare faţă de expunerea la mediu (Brosson et al., 2006).

Un alt exemplu de reducere este aceea a mitocondriei sau mitosomului, un organit recent descris la unele microsporidii, dar puţin caracterizat. Au fost găsite mai mult de o duzină de gene codificând proteine derivate din mitocondrii şi s-au localizat HSP70 mitocondriale pe mitosomi, suportând probabilitatea că microsporidiile au evoluat din ancestori care conţineau mitocondrii (Vivares et al., 2002; Thomarat et al., 2004; Gill şi Fast, 2006).

Din proteinele codificate în secvenţa genomică completă a lui Encephalitozoon cuniculi a fost îmbinată o idee asupra proceselor care ar avea loc în interiorul acestor organite. Acestea sugerează o mitocondrie cu un şuvoi înalt neîntrerupt, care pare să fi pierdut atât genomul cât şi lanţul de transport al electronilor.

A mai fost studiată mitocondria de Antonospora locustae (microsporidie care infectează insectele) arătându-se că funcţionarea sa poate să difere la această specie. Această mitocondrie apare mult mai complexă în modalitatea de importare a proteinelor, tipurile de metaboliţi pe care îi poate importa şi căile adăpostite în interiorul organitului, în comparaţie cu E. cuniculi. S-a început caracterizarea unora din aceste proteine adiţionale, pentru a înţelege cum şi de ce procesele mitocondriale diferă de la o specie la alta (Williams, 2007)..

Datele sugerează că funcţia mitocondrială la microsporidii poate fi destul de variabilă şi să arate diverse niveluri de reducere de a lungul filumului.

Top

COMPLEXITATEA MICROBIOTEI ACIDOFILE DIN EFLUENŢI INDUSTRIALI CU CONCENTRAŢII CRESCUTE DE IONI METALICI

Carmen Mădălina Cişmaşiu

Institutul de Biologie Bucuresţi, madalinabio@yahoo.com; carmen.cismasiu@ibiol.ro

Cercetarea în domeniul ecologiei mediilor extrem de acide, cu concentraţii crescute de ioni metalici, a relevat că complexitatea microbiotei acidofile este considerabilă. Aceasta cuprinde reprezentanţi din domeniul Bacteria şi Archaea, precum şi alte microorganisme cu efect sinergic sau antagonic asupra procesului de oxidare a minereurilor sulfurice (Zarnea, 1994; Johnson, 1999; Lazăr, 2001).

In mediile acide, există o corelaţie negativă între diversitatea speciilor şi numărul indivizilor din fiecare specie: numărul redus al speciilor într-o comunitate este compensat prin numărul mare al indivizilor. Modificările mediului determină modificări în structura comunităţilor de microorganisme (Zarnea, 1994; Cişmaşiu, 2008).

Produşii de metabolism ai microorganismelor acidofile, cum ar fi depunerile de limonit din apele reziduale ale minelor, sunt principalii indicatori ai prezenţei acestor microorganisme în mediu. Aceasta se poate observa mai pregnant în cazul consorţiilor, ansambluri de populaţii mixte de bacterii autotrofe şi heterotrofe acidofile, care au fost descoperite în diferite zone din lume. Astfel, în Rio Tinto au fost descoperite creşteri filamentoase de fungi şi alge, iar înflorirea algelor verzi se realizează doar ocazional. În această zonă, se mai găsesc şi o mare varietate de procariote acidofile (Lopez – Archille şi colab., 1995).

Caracterizarea structurală şi fiziologică a speciilor din comunitatea microbiană duce la descoperirea unui important număr de microorganisme noi, care datorită activităţii lor metabolice în condiţiile mediilor poluate, deţin un rol important în procesele de bioremediere a mediilor poluate cu metale grele. Exploatarea speciilor microbiene şi diversităţii lor metabolice va reprezenta în viitor baza pentru aplicaţiile de bioremediere.

Cunoaşterea influenţei condiţiilor de mediu asupra activităţii metabolice a microorganismelor acidofile este de interes atât din punct de vedere teoretic, deoarece completează cunoştinţele în domeniul ecologiei microbiene, cât şi din punct de vedere practic, pot fi diminuate/înlăturate o serie de efecte negative rezultate din activitatea acestora (Cişmaşiu, 2006).

In ecosistem, activitatea microorganismelor acidofile este complexă: (a) bacteriile acidofile înglobează eficient nutrienţii, aflaţi în mediile oligotrofe, reintrodu-ce sub formă de biomasă cantităţi semnificative de carbon organic dizolvat; (b) utilizănd o gamă largă de substanţe organice şi anorganice din sol, resturi vegetale şi animale, microorganismele acidofile introduc în reţeaua trofică substanţe alohtone, îmbogăţind ecosistemul oligotrof în nutrienţi; c) realizează conversia substanţelor vegetale şi animale în materie anorganică prin procesele de mineralizare, care restituie organismelor fotosintetizante nutrienţii esenţiali pentru activitatea lor; d) efectuează o serie de reacţii de oxido-reducere care modifică valorile de pH, t^o, Eh şi alte condiţii esenţiale pentru existenţa vieţii, în diferite zone ecologice ale mediilor acvatice; e) degradează substanţele “recalcitrante”, asimilează o gamă largă de produşi chimici şi reintroduc în reţeaua trofică substanţele inaccesibile altor categorii de microorganisme; f) acţionează ca agenţi geochimici, cu rol complex în diageneza rocilor şi depunerilor de compuşi ai Fe²⁺, Mn²⁺, Cu²⁺, Zn²⁺, Pb²⁺, S⁰.

In unele zone miniere din România prin activitatea intensă de extragere şi prelucrare a minereurilor rezultă ape şi deşeuri solide reziduale a căror depozitare a dus la crearea de iazuri de decantare întinse pe suprafete de zeci şi sute de hectare. Acestea reprezintă habitate miniere artificiale ce oferă condiţii propice dezvoltării microorganismelor acidofile, chemolitotrofe şi chemoorganotrofe (Lazăr şi colab. 1998; Voicu şi colab., 1999; Cişmaşiu, 2008).

Inţelegerea ecologiei microbiene a ecosistemelor apelor acide de mină este importantă pentru remedierea zonelor afectate de acestea şi aplicaţii de noi biotehnologii. Bioleşierea deşeurilor de minereuri sărace în metale implică folosirea capacităţii bacteriilor chemolitotrofe din genul Thiobacillus pentru solubilizarea metalelor din deşeuri miniere, care nu pot fi extrase folosind tehnicile fizico-chimice utilizate în mineritul tradiţional.

O altă aplicaţie biotehnologică a bacteriilor chemolitotrofe acidofile din genul Thiobacillus este creşterea eficienţei extragerii resturiilor de metale grele din soluţia de electroliză rezultate.în urma prelucrării bijuteriilor înainte de a fi aruncate (Cişmaşiu, 2005; Cişmaşiu şi colab., 2007, 2009).

Send mail to sorin.stefanut@ibiol.ro with questions or comments about this web site.
Last modified: 07/03/09