ETAPA 2 - Prepararea modelelor experimentale şi a metaboliţilor (final); experimente de laborator de obţinerea gelurilor ecologice cu enzime imobilizate pentru biocurăţarea modelelor experimentale îmbătrânite

Activităţile 2.1-2.3. Modelele experimentale de pictură murală executată în tehnica al fresco obţinute în prima etapă au fost îmbătrânite prin expunerea la variaţii de temperatură şi umiditate (I1) respectiv la radiaţii UV A şi UV B (I2). Expunerea la variaţii de temp şi umiditate a fost codificate I1 iar cea la radiaţii UVA SI UVB a fost codificate I2. Ulterior, acestea au fost caracterizate din punct de vedere mirobiologic, microscopic (optic şi electronic), colorimetric, spectroscopic şi imagistică hiperspectrală. Expunerea la variaţii de temperatură şi umiditate nu a determinat modificări majore în cazul consolidanţilor (Paraloid B72, Dispersie transparentă de cazeină-DTC) şi a depunerilor de ceară, ulei şi funingine. Opus, radiaţiile UV B au determinat modificări structurale atât în cazul consolidanţilor cât şi al depunerilor. Din punct de vedere microbiologic, încărcătura microbiană a tututror modelelor experimentale îmbătrânite a fost foarte redusă. Microorganismele izolate au fost în principal bacterii, iar acestea au provenit din aerospora.

Activitatea 2.4. - Analiza frescotecii UNAB pentru stabilirea studiului de caz s-a bazat pe aplicarea metodelor microbiologice, de microscopie, colorimetrie, spectroscopie şi imagistică hiperspectrală. Astfel, fragmente de frescă acoperite cu Paraloid B72, DTC, ceară, ulei şi funingine au fost caracterizate, iar rezultatele obţinute incluse în banca de date vor avea rolul de martori de referinţă pentru evaluarea biocurăţării.

Activitatea 2.5. - Determinarea calitativă şi cantitativă a metabiliţilor bacterieni de interes pentru biocurăţare a fost axată pe hidrolaze şi exopolizaharide. Un total de 222 tulpini microbiene (182 tulpini bacteriene şi 40 tulpini de microfungi) izolate anterior din cinci lacuri sărate din România au fost testate în vederea stabilirii potenţialului de a hidroliza diferiţi compuşi, precum proteinele (cazeina), esterii/uleiurile (compusul Tween 80 şi uleiul de măsline) şi polizaharidele (carboximetil celuloza şi xilanul). După testarea calitativă s-au selectat 94 tulpini bacteriene şi 15 tulpini de fungi producătoare proteaze extracelulare, 79 izolate bacteriene şi 13 izolate fungice care sintetizează esteraze extracelulare, 34 tulpini bacteriene şi 17 tulpini de microfungi cu potenţialul de a sintetiza enzime celulozolitice şi 53 izolate bacteriene respectiv 14 izolate microfungice care au capacitatea de a sintetiza enzime xilanolitice.

În urma testării cantitative a tulpinilor microbiene s-a constatat că cele mai bune producătoare de enzime proteolitice aparţin genului Bacillus, activitatea cea mai mare fiind înregistrată pentru tulpina bacteriană Bacillus sp. BAN P2.7 (61,2 U/mL). Activitatea esterazică maximă pentru tulpina fungică Penicillium sp. a fost 0,064 U/mL iar pentru Bacillus sp. BAN P3.3 a fost 0,124 U/mL. Bacillus sp. AM N P1.17 şi Penicillium sp. MM 1-4 au avut 2,55 U/mL activitate lipazică.

Producerea maximă a celulazelor, pentru Bacillus sp. AMN P1.17 (0,076 U/mL), s-a remarcat după 72 de ore de la inoculare, iar pentru tulpina Penicillium citrinum LS 3-2 (0,062 U/mL), după 5 zile de la inoculare.

Tulpina bacteriană Bacillus sp. BAN P1.4 prezintă capacitatea de a sintetiza cantităţi apreciabile de xilanaze (42,93 U/mL), în comparaţie cu celelalte tulpini microbiene testate.

O primă selectare a tulpinilor potenţial producătoare de polizaharide s-a efectuat pe baza aspectului macroscopic al coloniilor. Aspectul mucoid, suprafaţa lucioasă şi netedă a coloniilor indică o posibilă capacitate de sinteză a exopolizaharidelor. Intr-o altă etapă tulpinile BB49 şi 21PV selectate au fost cultivate pe mediu nutritiv lichid (0,1-0,12 g EPZ/10 ml) pentru biosinteza exopolizaharidelor în vederea purificării parţiale.

Activitatea 2.6. O colecţie de microorganisme ce conţine specii de microorganisme producătoare de enzime hidrolitice şi exopolizaharide a fost constituită. Aceasta conţine 3 specii de bacterii respectiv 3 specii de fungi producătoare de hidrolaze şi 3 specii de bacterii producătoare de exopolizaharide.

Activitatea 2.7. Izolarea şi purificarea parţială a hidrolazelor bacteriene s-a efectuat din lichide de cultură ale speciilor de bacterii cultivate în condiţii optime de creştere (mediu nutritiv, temperatură, salinitate, condiţii de agitare). Separarea şi purificarea enzimelor extracelulare, prezente în supernatant, au constat în precipitarea cu acetonă. După 24 de ore de menţinere la frigider, amestecul supernatant/acetonă a fost centrifugat, uscat şi resuspendat într-un volum minim de tampon fosfat de potasiu 0,05 M, pH 7 (în cazul celulazelor şi xilanazelor), pH 7,5 (în cazul esterazelor) sau pH 8 (în cazul proteazelor).

Activitatea 2.8. Optimizarea procesului de obţinere a gelurilor şi caracterizarea lor s-a efectuat pentru halopolizaharidul produs de o specie de bacterie, Vanzan, Kelkogel, Agarart şi Klucel (produse comerciale).

În scopul elaborării metodologiei de preparare a halohidrogelului (HG) s-a utilizat exopolimer sintetizat de tulpina bacteriană halotolerantă 21PV, adus în stadiul de pulbere prin mojarare. Diferite concentraţii de polizaharid: 1%, 1,5%, 2%, 10% au fost solubilizate în apă distilată şi în tampon fosfat de potasiu 0,05M, pH-7,5, fiind mai eficienta solubilizarea în tampon fosfat. S-a stabilit ca optimă concentraţia de 10%. Pentru imobilizarea preparatului enzimatic s-a utilizat un raport gel-enzima de 1:1. Produsul obţinut (E-HG) a fost aplicat pe pigmentul albastru pe modelele experimentale îmbătrânite prin metodele I1 şi I2. Biocurăţarea cu E-HG a modelelor experimentale îmbătrânite prin metoda I1 este mai eficientă după 5 ore de acţiune, iar cele îmbătrânite prin metoda I2 după 10 ore.

Pentru stabilirea timpului optim de aplicare şi a eficienţei biocurăţării cu E-Vanzan şi E-Kelcogel urmând metodologia de preparare a gelurilor elaborată de P1 preparatul enzimatic s-a imobilizat (1/1). Apoi, E-Vanzan şi E-Kelcogel au fost aplicate pe cei 4 pigmenţi de pe modelele experimentale îmbărânite prin metodele I1, timp de 5 ore şi 10 ore. Au urmat curăţarea mecanică şi examinarea eficienţei de către fiecare partener, conform expertizei. Metodologia de biocurăţare pentru modelele experimentale îmbătrânite prin metoda I1 a inclus gelul obţinut din Vanzan cu enzima imobilizată (E-Vanzan pentru toţi pigmenţii) şi gelul de Kelcogel (pentru toţi pigmenţii - enzima aplicată pe suprafaţa fiecărui pigment şi apoi ataşarea gelului- E+Kelcogel). Folosirea celor două geluri are la bază comportamentul acestora: Vanzanul intră în pori (nedorit de restauratori) iar Kelcogelul solidifică rapid şi enzima nu poate fi imobilizată.

Indepărtarea necorespunzătoare (E-Vanzan) şi rigiditatea gelurilor (Kelcogelul) a determinat folosirea E-Agarart pentru biocurăţarea modelelor îmbătrânite prin metode I2.

Pentru stabilirea timpului optim de aplicare şi a eficienţei biocurăţării cu E-Agarart şi E-Klucel urmând metodologia de preparare a gelurilor elaborată de P2 preparatul enzimatic s-a imobilizat (1/1). A fost evaluată eficienţa biocurăţării atât pe modelele experimentale îmbătrânite prin metoda I1 cât şi prin metoda I2. In cazul modelelor experimentale îmbătrânite prin metoda I1 s-a folosit gelul obţinut din Agarart deoarece conform informaţiilor din Raportul Stiinţific al P2 acesta îndeplineşte caracteristicile pentru folosirea în domeniul restaurării picturii murale. Incercările de folosire a gelului obţinut din Klucel nu a dat rezultate pozitive. Desi se aplică pe tifon şi apoi se uniformizează, trece prin acesta şi devine imposibilă îndepărtarea. In plus, pentru solubilizare este necesar un timp prelungit (24 ore). Pentru a se obţine un gel, cantitatea necesară este asemenea foarte mare (15-20%).

Rezultatele obţinute din aplicarea preparatului enzimatic prin diferite metode ne-au permis să selectăm pentru această etapă preparatul imobilizat în Agarart şi preparatul aplicat direct pe depunere urmat de plasarea gelului de Agarart. Timpul de tratament a fost de 10 ore. Astfel s-a confirmat reacţia chimică determinată de esterazele imobilizate, punându-se în evidenţă zone de diferite dimensiuni cu produşi intermediari de descompune a consolidanţilor Paraloid B72, DTC şi a depunerilor de ceară, ulei şi funingine. Rezultatele anlizelor interdisciplinare au permis recomandarea folosirii pentru experimentele viitoare a E-Agarart pentru hidroliza depunerilor de Paraloid B72, DTC şi funingine iar pentru descompunerea cerii şi uleiului, E+Agarart.

Diseminarea rezultatelor

Prezentări orale şi postere la conferinţe internationale şi naţionale:

Ruginescu R., Gomoiu I., Enache M., Neagu S., Cojoc R., Batrinescu-Moteau C., Iancu L., Purcarea C., Diversitatea microorganismelor halofile si halotolerante izolate din medii acvatice saline si potentialul lor biotehnologic, A 61-a Sesiune Anuală de Comunicări Stiinţifice a IBB, 10.12 2021 Bucureşti, - prezentare orală

Gomoiu I., Neagu S.,Enache M., Ruginescu R., Maria G.,Cojoc R. - Microorganismele halofile ca biodetriogeni şi surse pentru biotehnologii aplicabile în domeniul patrimoniului cultural, A 61-a Sesiune Anuală de Comunicări Stiinţifice a IBB, 10.12 2021, Bucureşti,- prezentare orală

Mohanu I., Fechet R.M., Petre I., Rădvan R., Ghervase L., Huică I., Gomoiu I. - Textural and chromatic evaluation of aged fresco models surface- poster, A 13-a conferinţa internatională CONSILOX, 01-03.10.2021, Alba Iulia, Romania - poster

Ruginescu R., Gomoiu I., Cojoc R., Enache M., Neagu S., Isolation and selection of microorganisms producing hydrolytic enzymes with potential application in the restoration of cultural heritage - poster, A 13-a conferinţa internatională CONSILOX, 01-03.10.2021, Alba Iulia, Romania - poster

Gomoiu I., Enache M., Neagu S., Ruginescu R., Dumbrăvician M., Radvan R., Ghervase L., Mohanu I., Cojoc R, Green biotechnologies used in the restoration of mural painting and lithic support: review, A 13-a conferinţa internatională CONSILOX, 01-03.10.2021, Alba Iulia, Romania - prezentare orală

Biocurăţarea picturii murale cu produse ecologie noi bazate pe metaboliţi microbieni (BIOCLEANMUR)-proiect 570PED/2020-poster, SALONUL INTERNAţIONAL DE INVENţII şI INOVAţII "TRAIAN VUIA"TIMIşOARA, EDIţIA A VII-A (06-08.10.2021)

Dumbrăvician M., Tomşe D., Cojoc R., Gomoiu I., Importanţa pentru restaurarea picturii murale a stării de conservare din punct de vedere al biodeteriorării.I. Studiu de caz: Fragment de pictură murală, scenă din sinaxar neidentificată, extras din pronaosul bisericii Mănăstirii Tismana, Restitutio, Conferinţa Naţională de Conservare şi Restaurare "Doina Darvaş", CONScience 2021, Muzeul Naţional al Satului Dimitrie Gusti, 04-05.11.2021, Bucureşti - prezentare orală

Lucrari trimise spre evaluare la reviste ISI:

Gomoiu I., Enache M., Neagu S., Ruginescu R., Dumbrăvician M., Radvan R., Ghervase L, Mohanu I., Cojoc R., Green biotechnologies used in the restoration of mural painting and lithic support: review - Romanian Journals of Materials-acceptat pentru publicare

Ruginescu R., Gomoiu I., Cojoc R., Enache M., Neagu S., Characterization of some salt-tolerant microbial hydrolases with potential utility in cultural heritage biocleaning - MDPI-Microbiology- în evaluare

Dumbrăvician M., Tomşe D., Cojoc R., Gomoiu I., Importanţa pentru restaurarea picturii murale a stării de conservare din punct de vedere al biodeteriorării.I. Studiu de caz: Fragment de pictură murală, scenă din sinaxar neidentificată, extras din pronaosul bisericii Mănăstirii Tismana, Restitutio, 2022- acceptată pentru publicare

Premii:

Diploma şi medalia de argint pentru posterul Biocurăţarea picturii murale cu produse ecologie noi bazate pe metaboliţi microbieni (BIOCLEANMUR)-proiect 570PED/2020-poster, SALONUL INTERNAţIONAL DE INVENţII şI INOVAţII "TRAIAN VUIA"TIMIşOARA, EDIţIA A VII-A (6-8octombrie2021)