Etapa 3. Validarea biocurăţarii pe modele experimentale şi elaborarea metodologiei de biocurăţare cu produse ecologice bazate pe metaboliţi microbieni

Activitatea 3.1. Validarea biocurăţării modelelor experimentale (bazată pe metaboliţi microbieni)

A fost elaborată metodologia de biocurăţare a modelelor experimentale de pictură murală îmbătrânite (Fig.1) şi a frescelor restaurate cu produse ecologice bazate pe metaboliţi microbieni. Aceasta include următoarele etape care se derulează succesiv: Obţinerea metaboliţilor microbieni; Obţinera gelurilor cu enzime esterolitice integrate; Aplicarea gelurilor pe suprafaţa modelelor experimentale îmbătrânite; Evaluarea eficienţei biocurăţării.

Metaboliţii microbieni obţinuţi în laborator au fost: complexul enzimatic esterolitic şi halopolizaharidul bacterian. Aceştia s-a obţinut prin cultivarea tulpinilor Bacillus sp. BA N P3.3, respectiv bacteria halotolerantă 21PV, pe medii nutritive şi în condiţii specifice. Complexul esterolitic a fost integrat în hidrogeluri şi s-au obţinut astfel: E-HG, E-Vanzan, E-Kelcogel, E-Agarart şi E-Klucel. Acestea s-au aplicat pe suprafaţa modelelor experimentale îmbătrânite acoperite de pelicule de Paraloid B72, dispersie transparentă de cazeină (DTC), ceară de albine (BW), ulei de floarea soarelui (SO) şi funingine (S). A fost testată şi varianta de aplicare a soluţiei enzimatice direct pe depunere (E+G), urmată de ataşarea gelurilor. Principalele metode de evaluare a eficienţei biocurăţării şi de validare a acesteia au fost: examinarea directă, examinarea microscopică, colorimetrie (Fig.2 -Fig.4), spectroscopie (FTIR) şi imagistică hiperspectrală. Informaţiile obţinute din aplicarea acestor metode sunt complementare şi asigură evaluarea riguroasă a biocurăţării.

Activitatea 3.2. Prepararea gelurilor şi imobilizarea hidrolazelor pentru biocurăţarea fragmentelor de frescă

Gelurile cu hidrolaze de tipul esterazelor s-au preparat după otimizarea proceselor de obţinere, integrare şi stabilirea timpului optim de biocurăţare. Hidrogelurile cu enzime încorporate s-au aplicat pe suprafaţa modelelor experimentale îmbătrânite după cum urmează:

- E-Vanzan, E-Klucel - prin pensulare sau cu ajutorul unei spatule;

- E-Kelcogel şi E-Agarart, după decupare în funcţie de dimensiunea dorită;

- HG, cu ajutorul baghetei Drigalski.

3.3. Stabilirea timpului optim de aplicare şi a eficienţei biocurăţării cu E-geluri atât a frescelor restaurate cu DTC şi Paraloid B-72 cât şi a celor cu depuneri accidentale (ceară, ulei de floarea soarelui, funingine, Fig.1)

Toate E-Gelurile cu o singură excepţie au fost aplicate direct pe depunerile existente la suprafaţa fregmentelor de frescă. Excepţia a fost reprezentată de E-Klucel care s-a aplicat pe un strat intermediar de tifon. Tratamentul s-a efectuat la temperatura de 20-25 ^oC, timp de 10 min pentru toate gelurile şi de 24 ore pentru E-HG şi E-Agarart.

Eficienţa biocurăţării cu E-Vanzan şi E-Kelcogel

Analiza macroscopică în lumină directă şi razantă efectuată după îndepărtarea gelurilor şi curăţarea mecanică nu a pus în evidenţă modificări morfologice/estetice pe depunerile reprezentate de B72, DTC, ceară şi ulei ci numai pe depunerile de funingine.

Analiza la microscopul optic a permis identificarea unor zone de mărimi diferite în care aspectul lucios conferit de Paraloid B72, DTC şi SO s-a transformat în aspect mat cel mai probabil ca efect al hidrolizei enzimatice.

Analiza la microscopul electronic a demonstrat că biocurăţarea cu E-Vanzan şi E+ Kelcogel a fost eficientă. Pe imaginile SEM s-a constatat că pe toate fragmentele de frescă respectiv pe toate depunerile, sunt zone de mărime semnificativă de hidroliză pentru E-Vanzan (cu precipitarea tamponului) şi mai mică pentru E+ Kelcogel. Identificarea în unii pori a Vanzan-ului şi rigiditatea Kelcogelului care determină zgârieturi ale stratului de culoare nu permit recomandarea produselor E-Vanzan, E+Vanzan, E+Kelcogel pentru biocurăţare.

Eficienţa biocurăţării cu E-Klucel

Incercările de folosire a gelului obţinut din Klucel nu a dat rezultate pozitive. Deşi se aplică pe tifon şi apoi se uniformizează, gelul trece prin acesta şi devine imposibilă îndepărtarea din pori, constatare ce nu permit recomandarea produselor E-Klucel şi E+Klucel pentru biocurăţare.

Eficienţa biocurăţării cu E+Agarart şi E+HG

Frescele acoperite cu Paraloid B72 biocurăţate cu E+Agarart, apar la microscopul optic, aproape în întregime curăţate, iar hidrogelul se îndepărtează cu uşurinţă. Observaţiile la SEM au permis identificarea curăţării totale numai în zonele în care Paraloid B72 nu a pătruns în porii frescei. Rezultatele au fost confirmate prin colorimetrie, FTIR şi imagistica hiperspectrală.

După aplicarea E+HG, la microscopul optic, se observă că acesta nu se îndepărtează în totalitate dar, în zonele fără HG este evidentă biocurăţarea. Eficienţa a fost demonstrată şi prin examinarea probelor la SEM, colorimetrie, FTIR şi imagistica hiperspectrală. Se apreciază că eficienţa este mai mare în cazul E+HG. Sunt necesare cercetări suplimentare pentru îndepărtarea în totalitate a HG.

Frescele acoperite cu DTC biocurăţate cu E+Agarart, apar la microscopul optic aproape în întregime curăţate deşi s-au observat zone în care acesta mai persista. Observaţiile la SEM, colorimetria, FTIR şi imagistica hiperspectrală au permis identificarea unor zone extinse biocurăţate. In cazul în care DTC pătrunde în pori, se consideră că procesul de biocurăţare are loc numai la suprafaţă. Pentru a fi soluţionat acest aspect sunt necesare cercetări suplimentare.

După aplicarea E+HG, la microscopul optic, se observă că acesta se îndepărtează mai greu în comparaţie cu E+Agarart. Eficienţa E+HG este mai mică decât cea a hidrogelului de E+Agarart dar, în zonele fără HG este evidentă biocurăţarea. Eficienţa a fost demonstrată şi prin examinarea probelor la SEM, colorimetrie, FTIR şi imagistica hiperspectrală. Se apreciază că eficienţa este mai mare în cazul E+Agarart. Sunt necesare cercetări suplimentare pentru îndepărtarea în totalitate a HG. Deşi considerăm că prin ambele metode se obţine biocurăţarea, în absenţa cercetărilor referitoare la îndepărtarea HG, recomandăm E+Agarart.

Frescele acoperite cu ceară biocurăţate cu E+Agarart, apar la microscopul optic aproape în întregime curăţate dar se presupune că grosimea stratului de ceară în zona tratamentului a fost redusă. Observaţiile la SEM au demonstrat că deşi sunt zone mari unde descompunerea cerii a avut loc în totalitate, persistă şi zone cu un strat foarte subţire de ceară.

După aplicarea E+HG, la microscopul optic, se observă straturi de ceară de grosimi diferite atribuite acţiunii hidrolitice a preparatului enzimatic ce conţine esteraze. Eterogenitatea stratului de ceară precum şi zonele în care loc biocurăţarea sunt evidente în observaţiile efectuate la SEM, prin colorimetrie, FTIR şi imagistica hiperspectrală. Aplicarea lor in situ se poate face numai după îndepărtarea/egalizarea grosimii stratului de ceară.

Frescele cu depuneri de ulei de floarea soarelui biocurăţate cu E+Agarart şi E+HG apar la microscopul optic aproape în întregime curăţate, deşi s-au observat zone cu mici fragmente de HG. Observaţiile la SEM, colorimetria, FTIR şi imagistica hiperspectrală au demonstrat că există zone extinse biocurăţate. Considerăm că, prin ambele metode se obţine biocurăţarea dar, este necesară aprofundarea cercetărilor de îndepărtare a HG.

Pe frescele acoperite cu funingine şi biocurăţate cu E+Agarart, la microscopul optic s-au pus în evidenţă zone în care aceasta a fost îndepărtată dar şi zone în care hidrogelul încă există. Observaţiile la SEM au demonstrat că pe suprafaţa analizată există zone curăţate dar şi zone în care acest proces nu este total.

După aplicarea E+HG, la microscopul optic, se observă că acesta se îndepărtează mai greu în comparaţie cu E+Agarart. Eficienţa E+HG pare a fi mai mică decât cea a hidrogelului de E+Agarart dar, în zonele fără HG este evidentă biocurăţarea. Eficienţa a fost demonstrată şi prin examinarea probelor la SEM, colorimetrie, FTIR şi imagistica hiperspectrală. Sunt necesare cercetări suplimentare pentru îndepărtarea în totalitate a HG. Considerăm că prin ambele metode se obţine biocurăţarea dar, în absenţa cercetărilor referitoare la îndepărtarea HG, recomandăm E+Agarart.

3.4. Analiza stării de conservare a frescelor restaurate şi validarea biocurăţării acestora folosind produse ecologice bazate pe metaboliţi microbieni

Starea de conservare a frescelor biocurăţate este apreciată ca fiind bună atât înainte cât şi după biocurăţare. Din punct de vedere microbiologic şi biochimic nu s-au pus în evidenţă unităţi formatoare de colonii microbiene respectiv enzime esterolitice active pe stratul pictural. Rezultatele obţinute prin analizele efectuate la microscopul optic, SEM, colorimetrie, FTIR şi imagistică hiperspectrală au validat eficienţa biocurăţării cu E-Agarart, E+Agarart, E-HG şi E+HG.

3.5. Raport de validarea biocurăţării picturii murale cu produse ecologice bazate pe metaboliţi microbieni

Rezultatele cercetării au condus la elaborarea strategiei de curăţare a picturii murale bazată pe o metodologie ecologică nedistructivă de biocurăţare a materialelor îmbătrânite şi a unor materiale organice acumulate accidental pe suprafaţa picturilor murale, bazată pe metaboliţi bacterieni obţinuţi în condiţii de laborator controlate. Metoda propusă conduce la dezvoltarea unei biotehnologii (tehnologie verde) care utilizează bacterii halofile producătoare de enzime esterolitice şi halopolizaharide. Noua metodologie elimină toxicitatea solvenţilor folosiţi în curăţarea chimică, este ecologică, prietenoasă cu mediul, picturile murale şi restauratori.

Avantajele procesului de biocurăţare sunt următoarele:

- procesul este selectiv, deoarece se îndepărtează depunerile;

- procesul este nedistructiv pentru că nu este afectată starea de conservare a suprafeţei tratate;

- procesul este reproductibil şi nu necesită condiţii speciale de mediu deoarece enzimele rămân active timp de 24 ore şi în acelaşi timp sunt protejate de gelul în care sunt încorporate;

- microorganismele sunt nepatogene, nu sporulează şi au necesităţi reduse de creştere;

- metodologia nu este riscantă pentru operatori, vizitatori şi pentru mediu;

- costurile sunt reduse.

Strategia de curăţare a picturii murale include următoarele activităţi:

- selectarea tulpinilor de bacterii halofile care sintetizează enzime hidrolitice, în principal esteraze;

- selectarea tulpinilor de bacterii halofile care sintetizează halopolizaharide;

- stabilirea condiţiilor optime de biosinteză a enzimelor esterolitice şi a halopolizaharidelor;

- stabilirea condiţiilor optime de obţinere a enzimelor esterolitice şi a halopolizaharidelor din mediile de cultură;

- caracterizarea enzimelor esterolitice şi a halopolizaharidelor;

- selectarea sistemului de încorporare adecvat pentru complexul esterolitic;

- obţinere modelelor experimentale cu depuneri organice şi îmbătrânitrea acestora;

- stabilirea metodologiei de aplicare şi a timpului de acţiune pe modelelor experimentale;

- optimizarea condiţiilor de aplicare în laborator;

- evaluarea eficienţei şi validarea metodei pe modele experimentale;

- aplicarea pe modele îmbogăţite artificial şi pe fragmente de frescă;

- monitorizarea procesului în timpul aplicării;

- îndepărtarea hidrogelurilor cu esteraze încorporate şi curăţarea suprafeţelor tratate;

- evaluarea eficienţei procesului de biocurăţare;

- monitorizarea suprafeţei tratate pe termen scurt şi mediu (din punct de vedere microbiologic şi estetic).

Prezentarea succintă a rezultatelor obţinute

In cadrul proiectului 570 PED/2020 - Biocuraţarea picturii murale cu produse ecologice noi bazate pe metaboliţi microbieni (BioCleanMur) finanţat de UEFISCDI, a fost dezvoltată şi validată metodologia de obţinere a metaboliţilor microbieni pentru elaborarea strategiei de biocurăţare a picturii murale restaurate cu consolidanţi (Paraloid B72 şi Dispersie Transparentă de Cazeină) şi depuneri acidentale (ceară, ulei de floarea soarelui şi funingine). Astfel, în condiţii de laborator controlate s-au stabilit condiţiile optime de biosinteză ale enzimelor şi exopolizaharidelor de către tulpini de bacterii halofile. Geluri ce conţin enzime integrate au fost aplicate pe suprafaţa picturii murale (Fig.1), iar după îndepărtarea acestora, evaluarea biocurăţării s-a efectuat prin metode specifice (Fig.2 - Fig.4).

Fig.1-Fig.4.Biocurăţarea modelelor experimentale şi validarea prin microscopie optică, electronică cu baleiaj şi colorimetrie.

.

3.6. Diseminarea rezultatelor

- 5 prezentări orale la conferinţe naţionale;

- 3 postere la conferinţe şi saloane de cercetare;

- 1 poster la o conferinţă internaţională;

- 5 lucrări publicate;

- 2 lucrări în curs de publicare;

- Propuneri brevete de invenţie

Diseminarea rezultatelor

Prezentări orale şi postere la conferinţe naţionale:

1. Gomoiu I., Ghervase L., Mohanu I., Biocleaning of mural paintings with new ecological products based on microbial metabolites, 14 th European Exhibition of Creativity and Innovation, Palatul Culturii, Ia?i, 26-28 mai 2022 (poster)

2. Ghervase L., Dinu M., Atanassova A, Gomoiu I., Radvan R., Assessing the usefulness of laser-based techniques for evaluating the biocleaning of mural paintings, Lasers in the Conservation of Artworks (LACONA XIII), Florence, Italy,13-17 septembrie 2022 (poster)

3. Gomoiu I., Ghervase L., Rădvan R., Procedure for the removal of consolidants and orgnic deposits from the surface of mural paintings using microfungi cultures, A VIII-a ediţie a Salonului Interna?ional de Inven?ii şi Inovaţii "Traian Vuia", Universitatea Tehnică Cluj-Napoca, 8-10 octombrie 2022 (prezentare orală)

4. Gomoiu I., Ghervase L., Rădvan R., Procedeu de îndepărtare a consolidanţilor şi a depunerilor organice de pe suprafaţa picturilor murale folosind culturi de microfungi, Salonul Interna?ional al Cercetării ştiinţifice, Inovării şi Inventicii PRO INVENT, Universitatea Tehnică Cluj-Napoca, 26-28 octombrie 2022 (poster)

5. Gomoiu I., Ruginescu R., Neagu S.E., Cojoc R.L., Enache M., Ghervase L., Rădvan R., Mohanu I., Procedeu de îndepărtare a consolidanţilor şi a depunerilor organice de pe suprafa?ă picturilor murale folosind esteraze imobilizate în gel pe bază de polizaharide, Salonul Internaţional al Cercetării ştiinţifice, Inovării ?i Inventicii PRO INVENT, Universitatea Tehnică Cluj-Napoca, 26-28 octombrie 2022 (poster)

6. Gomoiu I., Dumbrăvician M., Ghervase L., Curăţarea picturii murale prin procedee mecanice, fizice, chimice si biologice, Conferinţa Naţională de Conservare - Restaurare "Doina Darvaş" - CONScience 2022, Muzeul Naţional al Satului "Dimitrie Gusti"Bucureşti, 2-4 noiembrie 2022.

7. Neagu S., Gomoiu I., Cojoc R., Enache M., Ruginescu R., Purificarea şi caracterizarea unor enzime hidrolitice extracelulare sintetizate de microorganisme halofile şi halotolerante cu potenţial aplicativ în biocurăţarea picturilor murale, Conferinţa Anuală de Microbiologie " G. Zarnea", Institutul de Biologie Bucureşti, 29.09.2022.

8. Cojoc R., Neagu S., Ruginescu R., Enache M., Gomoiu I., Exopolizaharide produse de bacterii halotolerante ca suport pentru preparate enzimatice utilizate in biocurăţarea picturii murale, Conferinţa Anuală de Microbiologie " G. Zarnea", Institutul de Biologie Bucureşti, 29.09.2022.

9. Gomoiu I., Luminiţa Ghervase, Ileana Mohanu, Curăţarea picturii murale - de la curaţarea mecanică la cea ecologicăConferinţa Anuală de Microbiologie "G. Zarnea", Institutul de Biologie Bucureşti, 29.09.2022.

Lucrari publicate:

1. Ruginescu R., Enache M., Popescu O., Gomoiu I., Cojoc R., Batrinescu-Moteau C., Maria G., Dumbrăvician M., Neagu S., Characterization of some salt-tolerant bacterial hydrolases with potential utility in cultural heritage bio-cleaning. Microorganisms 2022, 10, 644

2. Gomoiu I., Cojoc R., Ruginescu R., Neagu S., Enache M., Dumbravician M., Olteanu I., Radvan R., Ghervase l., The Susceptibility to Biodegradation of Some Consolidants Used in the Restoration of Mural Paintings. Appl.Sci. 2022, 12, 7229

3. Gomoiu I., Cojoc R., Ruginescu R., Neagu S., Enache M., Dumbravician M., Olteanu I., RadvanR., Ratoiu L.-C.et al. Brackish and Hypersaline Lakes as Potential Reservoir for Enzymes Involved in Decomposition of Organic Materials on Frescoes.Fermentation 2022, 8 (9), 462. https://doi.org/10.3390/fermentation8090462

4. Ghid de curăţarea picturii murale- de la curăţarea mecanică la cea ecologica, I.Gomoiu Ed, UNARTE, ISBN 978-606-720-166-6, 88p.

5. Gomoiu I.,Ghervase L., Mohanu I., Dumbrăcivian M., Noi metode ecologice de curatare a picturii murale. 2022, Market Watch, 241, 30-31.

Lucrări acceptate pentru publicare:

1. Gomoiu I., Enache M., Neagu S., Ruginescu R., Dumbrăvician M., Radvan R., Ghervase L., Mohanu I., Cojoc R., Biocleaning of wall painting with microbial esterases immobilised in agarart - Romanian Journal of Materials

2. Dumbrăvician M., Tomşe D., Cojoc R., Gomoiu I., Importanţa pentru restaurarea picturii murale a stării de conservare din punct de vedere al biodeteriorării.I. Studiu de caz: Fragment de pictură murală, scenă din sinaxar neidentificată, extras din pronaosul bisericii Mănăstirii Tismana, Restitutio, 2022

Propuneri brevete de invenţie:

1. Procedeu de îndepărtare a consolidanţilor şi a depunerilor organice de pe suprafaţa picturilor murale folosind culturi de microfungi- A/00194-15.04.2022

2. Procedeu de îndepărtare a consolidanţilor şi a depunerilor organice de pe suprafaţa picturilor murale folosind esteraze bacteriene imobilizate în gel pe baza de polizaharide -A/00195 - 15.04.2022

Alte rezultate:

1. Masa rotundă Curăţarea picturii murale - de la curaţarea mecanică la cea ecologică, Institutul de Biologie Bucureşti, Institutul de Cercetare-Dezvoltare pentru Optoelectronică INOE 2000, CEPROCIM SA, Conferinţa Anuală de Microbiologie " G. Zarnea", Institutul de Biologie Bucureşti, 29.09.2022;

2. 5 geluri (Vanzan, Kelcogel, Agarart, Halogel, Klucel) în care s-a integrat complexul esterolitic obţinându-se E-Vanzan, E-Kelcogel, E-Agarart, EHG., E-Klucel

3. strategia de curăţare a picturii murale care include: obţinerea preparatului esterolitic, a halopolizaharidului şi a Agarart; integrarea preparatului esterolitic în Halohidrogel (HG) şi gelul de Agarart; obţinerea E-HG respectiv E-Agarart; aplicarea E-HG respectiv E-Agarart pe pictura murală cu depuneri organice; incubarea timp de 24 ore; îndepărtarea E-HG respectiv E-Agarart; curăţarea cu tamponul umectat în apă distilată; evaluarea eficienţei tratamentului prin examinarea directă, microscopică şi colorimetrică;

4. Raportul Stiinţific şi Tehnic pentru etapa 3;

5. Raportul Stiinţific şi Tehnic final